蓝舌病病毒8型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据蓝舌病病毒8型(BTV-8) VP2基因序列(Seg-2)设计特异性引物和探针,建立了BTV-8实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法。结果表明该法特异性强,能准确检测BTV-8核酸,与蓝舌病病毒其他血清型病毒、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)等病原核酸无交叉反应;最低可检测核酸浓度为2.8×10~3 copies/mL;Ct值组内和组间变异系数(CV)均小于2%。用所建立方法对115份临床样品进行检测,结果均为阴性,与文献报道的方法检测结果一致。建立的RT-qPCR方法可用于BTV-8的临床检测和流行病学调查。     

检测新城疫病毒的纳米PCR技术建立与初步应用

根据Gen Bank登录的新城疫病毒(NDV)M基因核苷酸序列设计引物,建立了NDV纳米PCR检测方法。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对NDV的最低核酸检出量分别为27 pg,比传统PCR敏感10倍,可扩增出297 bp的特异性核酸片段,而对禽流感病毒、传染性法氏囊病毒与传染性支气管炎病毒的检测结果均为阴性。该方法可用于新城疫病毒的临床快速检测与流行病学调查。     

禽腺病毒4型PCR检测方法的建立与应用

根据禽腺病毒4型(FAdV-4)Hexon基因核苷酸序列,设计用于扩增FAdV-4的PCR引物,建立了FAdV-4 PCR检测方法。特异性和敏感性实验结果表明,该方法可扩增出954 bp的特异性核酸片段,而对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒与禽腺病毒11型的检测结果均为阴性,对FAdV-4的最低核酸检出量为12.9 pg。该方法可用于禽腺病毒4型的临床检测与流行病学调查。     

塞内卡谷病毒和口蹄疫病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立塞内卡谷病毒(SVV)和口蹄疫病毒(FMDV)的快速鉴别检测方法,本试验根据SVV 3D基因序列和FMDV 3D基因序列,分别设计探针和引物,建立了可同时检测SVV和FMDV的双重荧光RT-PCR法。结果表明,该方法特异性强,能准确检测出SVV核酸和FMDV核酸,与水泡性口炎病毒(VSV-IND和VSV-NJ)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)等病原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测到SVV和FMDV核酸质量浓度分别为1.35×10~(-5),1.68×10~(-5) mg/L。重复性好,Ct值变异系数小于4%。利用所建立方法对116份已知的临床样品进行检测,结果与参比方法一致。本试验建立的方法可用于SVV和FMDV的鉴别检测,为塞内卡病毒病和口蹄疫的诊断提供依据。     

一例猪伪狂犬病野毒感染的实验室诊断

为确诊衡阳市某猪场育肥猪发生的疑似猪伪狂犬病(PR)疫情,采集发病猪脾脏,运用PCR方法进行猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸检测,利用非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)进行病毒血清学鉴定;用分离培养物进行家兔感染试验,观察临床症状和病例剖检变化,采用PCR检测各器官中的病毒分布情况。结果显示:病料接种Vero细胞培养3 d后,出现明显的细胞病变效应(CPE);分离培养的病毒与PRV阳性血清呈阳性反应;家兔感染后出现奇痒等神经症状并死亡,其肝、脾组织均为PRV gE核酸检测阳性。试验结果证实,分离到的病毒为PRV野毒,从而确诊了该疑似疫情。     

狂犬病的实验室诊断

狂犬病是由弹状病毒科、狂犬病病毒属的嗜神经病毒引起的一种世界性的人兽共患病.一旦出现症状,病死率近100％.由于该病无特征性大体病变,因而建立敏感、快速、准确的实验室诊断方法对狂犬病的防控工作至关重要.实验室诊断通常需要采集来自中枢神经的脑组织样本.通过病理组织学染色观察内基小体(Negri)是一种经典的实验室诊断方法,但是由于方法敏感性低,易受样本自溶的干扰,而已趋向于淘汰.抗原检测技术中首推的是荧光抗体试验(FAT):丙酮固定的脑组织切片在用荧光抗体染色后,可在荧光显微镜下观察是否有病毒包涵体或者病毒颗粒.此外,随着胶体金免疫层析法(GICA)在病原及小分子物质检测领域的快速发展,近年还出现了该技术用于狂犬病抗原检测的研究,且取得了较好效果.此外,小鼠颅内接种(MIT)和细胞培养分离(CIT)除了可用于狂犬病病毒培养外,还可单独作为诊断手段,或者配合FAT进行病原诊断.新鲜材料得到的单份阴性结果往往需要进行以MIT和CIT来进行再确认.此外巢式逆转录-聚合酶链式反应(Nested RT-PCR)可通过检测狂犬病病毒核酸来诊断病原,并进行分型.狂犬病的血清学试验在抗原诊断方面价值不大,多用于动物体内保护性抗体的检测.血清学试验中,荧光抗体中和试验(FAVN)及快速荧光抑制灶试验(RFFIT)是国际贸易规定的病毒中和试验.酶联免疫吸附试验(ELISA)也是一种快速、灵敏的血清学抗体检测方法,且如今已有包被狂犬病病毒G蛋白的间接ELISA试剂盒销售.     

非洲猪瘟病毒核酸定性检测方法比对

为提升兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测能力和质量控制水平,积累检测经验,以更好地开展非洲猪瘟检测,2020年7月,参加了北京市农业农村局组织的“非洲猪瘟实验室检测能力比对”项目。本次比对同时选用《非洲猪瘟检疫技术规范》(SNT 1559—2010标准)中的普通PCR方法、荧光定量PCR方法以及商品化试剂盒,对5份验证样品开展非洲猪瘟病毒核酸检测和结果比对。比对发现,3种检测方法结果一致,样品检测结果与预期一致,结果满意。此次比对确认了实验室现有检测方法能够满足非洲猪瘟病毒核酸的日常检测需求,同时提升了实验室人员的检测能力,积累了检测经验,可为非洲猪瘟防控提供有力的技术支撑。     

我国动物核酸探针的研究进展

核酸探针技术,是近几年来发展起来的新的检测方法和研究手段,它与传统的和新近发展起来的各种免疫学和血清学方法相比较,具有灵敏度高、特异性强、使用方便及核酸探针便于大批量生产等优点。自八十年代初用于诊断单纯疱疹病毒以来,已发展成为病毒、细菌和寄生虫病、遗传病等的临     

聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定禽呼肠孤病毒

从感染禽呼肠孤病毒的细胞中,以SDS和酚提取病毒核酸,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法将分节段的核酸分开,经银染色显示,呈3-3-1-3分布,此法可用于禽呼肠孤病毒的快速检测、鉴定。同样方法未能使传染性法氏囊病毒核酸显示。     

2017—2020年云南省丽江市羊小反刍兽疫监测

为了解云南省丽江市羊小反刍兽疫(PPR)的免疫状况和病毒感染情况,2017—2020年在全市范围内累计采集580个场点的4002份血清学样品和2556份病原学样品,分别采用ELISA方法和荧光RT-PCR方法进行抗体检测和病毒核酸检测,并对检测结果进行统计分析.结果显示:2017—2020年丽江市羊PPR个体免疫合格率...     

猪圆环病毒2型RPA恒温扩增检测方法的建立及初步应用

利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),以猪圆环病毒2型Cap基因的保守序列为靶序列设计并筛选出一组特异性的引物和探针,建立了快速检测猪圆环病毒2型核酸的RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)核酸检测结果均为阴性,灵敏性高,最低可检出核酸浓度为0. 87×10-4ng/μL,简单快速,且重复性好。利用所建立的RPA方法对183份临床样品进行检测,结果与实时荧光PCR方法符合率为98. 9%。本研究为猪圆环病毒2型核酸的快速检测提供了一种新方法,尤其适合基层实验室或养猪场的快速检测。     

猪脑心肌炎病毒RT-PCR检测方法的建立

为了对猪脑心肌炎病毒(EMCV)进行血清学调查和临床检测,试验根据猪脑心肌炎病毒5'端结构蛋白VP2基因序列设计、合成1对特异性引物,建立检测猪脑心肌炎病毒385 bp片段的RT-PCR检测方法。结果表明:该方法对脑心肌炎标准毒株VR-129B(GenBank登录号为X74312)的检测结果为阳性,对标准毒株的细胞培养物检测的敏感度达0.1TCID50;而对猪乙型脑炎病毒、戊型肝炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒的检测结果为阴性。说明该方法特异性强、灵敏性高,可以用于猪脑心肌炎病毒的检测和早期诊断。     

我国首例小反刍兽疫诊断报告

2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。     

非洲猪瘟病毒常规PCR及Real-time PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因的核苷酸序列,设计并合成引物以及荧光标记的TaqMan探针,以含P72基因的重组质粒作为阳性模板,用于常规PCR和Real-time PCR方法的建立,结果表明常规PCR的检测灵敏度是600个拷贝的病毒核酸分子,Real-time PCR的检测灵敏度是20个拷贝的病毒核酸分子,两种PCR检测方法均具有特异性强、简单快速的优点。可以用于出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测。     

荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。     

检测鸭1型甲肝病毒抗体间接ELISA方法的建立

为了建立快速检测鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)抗体的血清学方法,本试验利用纯化浓缩的鸭1型甲肝病毒亚型MPZJ1206株病毒作为包被抗原,建立了检测DHAV-1a血清抗体的间接ELISA方法,并对各种检测条件进行了优化。结果表明,该方法简单、快速、特异性强、重复性好、稳定性高,可用于鸭群DHAV-1a感染的血清学监测及其抗体消长规律的检测。     

犬细小病毒2c亚型毒株的分离与鉴定

采集一疑似犬细小病毒(CPV)患犬的粪便,用纳米PCR方法对病料进行CPV检测,并应用猫肾细胞F81进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒在F81细胞中的增殖动态。利用PCR扩增分离病毒的VP2基因,测序结果用DNAMAN软件对获得的VP2基因序列进行拼接,并与NCBI上已经公布的犬细小病毒的全基因组序列以及相关蛋白的核酸序列进行比较,确定其所分离的病毒株型并推导氨基酸序列。结果表明,纳米PCR检测结果为CPV核酸阳性,病料接种到F81细胞培养后出现明显细胞病变(CPE),血清学鉴定为CPV抗原阳性,序列测定分析表明,该毒株VP2基因开放阅读框(ORF)为1755 bp。进化分析显示,该毒株属于CPV-2c型,并命名为CPV-2c-Guangxi23。     

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立

针对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)基因保守序列,设计特异性引物和荧光探针,建立了LCMV实时重组聚合酶等温扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测方法。该检测方法具有良好的特异性,与LCMV同步检测的其他鼠病毒均未出现交叉反应;该检测方法具有与RT-PCR一样的高敏感性;通过对LCMV感染鼠组织样本和LCMV阴性鼠血清样本的检测,证实建立的实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA检测方法在核酸上样20 min内即可判读结果,可满足啮齿类动物LCMV快速检疫需要。     

斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法的建立

旨在建立一种基于PCR的焦磷酸测序检测方法,用于斑点叉尾鮰病毒病的快速检测和确诊。针对斑点叉尾鮰病毒(CCV)蛋白激酶(PK)基因的保守区域设计扩增引物与测序引物,经PCR扩增后对PCR产物进行焦磷酸测序,借助测序结果比对确定是否为CCV核酸序列。通过对反应条件与体系的优化,成功建立了CCV PK基因焦磷酸测序检测方法。结果表明:建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法扩增基因片段长度为144 bp,能够特异性检测出目的病毒,最低核酸检测限为5×10-6ng/μL,重复测序3次均能准确测出45 bp核酸序列。本研究建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适合高通量检测且耗时短仅需4 h,为CCV的快速检测提供了一种可行方法。     

牛白血病病毒LUX^TM实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立

采用LUXTM新型荧光PCR技术原理,设计并合成1对单标记LUXTM荧光引物.建立了LUXTM荧光PCR和RT-PCR方法,可快速检测牛白血病病毒(BLV)前病毒DNA和病毒RNA.结果显示所建立的LUXTM荧光PCR/RT-PCR体系可特异检测牛白血病病毒核酸,而对蓝舌病、牛病毒性腹泻-粘膜病、水泡性口炎、口蹄疫、牛流行热、牛传染性鼻气管炎等病毒核酸以及牛结核分支杆菌、大肠杆菌、健康动物组织核酸扩增均呈阴性反应.敏感性实验表明LUXTM荧光RT-PCR对RNA前病毒的检测敏感性达0.49 ng/μL,荧光PCR对pTblv-gp51重组质粒的检测敏感性可达0.138拷贝,比OIE规程的巢式PCR方法高104倍以上.采用该方法从血清学阳性临床牛血清中检出BLV阳性样品.