广西边境地区家禽H9亚型流感病毒调查

为了解中越边境地区H9亚型禽流感病毒(AIV)的流行情况,本研究收集2012年12月～2015年12月广西边境地区主要活禽市场和养殖场的家禽拭子及环境样品,采用病原分离和鉴定方法对样品进行了分析。结果显示,H9亚型AIV整体分离率为3.01%,其中冬春季节(3.47%)高于夏秋两季(1.39%);市场样品的病毒分离率(3.73%)高于养殖场(1.53%);在鸡、鸭、鹅源样品中均能检测到H9亚型AIV,其中鸡源样品的H9亚型AIV分离率最高(7.68%),鹅次之(1.43%)。本研究表明,H9亚型AIV在广西边境地区表现出一定的时间、空间和群间分布特征。本研究对H9亚型AIV进行跟踪监测可为预防和控制禽流感提供重要的流行病学信息。     

应用荧光定量RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒

针对J亚群禽白血病病毒（ALV-J）基因序列保守区域设计一对特异性引物和一条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒作为阳性标准品,建立了检测ALV-J核酸的荧光定量PCR方法。优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如A亚群禽白血病病毒（ALV-A）、B亚群禽白血病病毒（ALV-B）、新城疫病毒（ NDV）、禽流感病毒（AIV）、鸡传染性贫血病毒（CIAV）和马立克病病毒（MDV）均不发生交叉反应;该方法可检测到3.2×102拷贝/μL的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。研究结果表明,建立的Real-time RT-PCR 检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于ALV-J的定量检测。     

广西边境地区活禽批发市场禽流感流行病学监测

为了给广西边境地区重大动物疫病防控阻截带建设提供数据支持,以及了解中越边境地区家禽禽流感病毒生态学,2012年12月—2017年12月,对广西边境地区主要活禽批发市场家禽及市场环境进行了系统监测。结果显示:广西边境地区活禽批发市场内禽流感病毒污染较重,呈多亚型病毒共存状态;家禽样品的平均病毒分离率为15.95%,环境样品则高达23.65%,明显高于家禽样品。市场调查发现:广西9个边境县(市、区)中,年活禽交易量在100万只以上的有5个;市场交易活禽主要为本地散养或规模场养殖家禽、从其他地区批发转运来的家禽以及边境走私家禽;大部分活禽市场没有配备消毒和无害化处理设施,也未严格执行休市制度。监测和调查结果表明,广西边境地区活禽批发市场家禽交易量大且频繁,来源复杂;市场中禽流感病毒污染严重,多亚型病毒在市场内常年蓄积循环,且存在家禽隐性带毒现象,因而有病毒散播风险。污染严重主要是因市场管理水平不高和生物安全措施不到位造成的,因此需要加强市场的动物卫生监管,提高禽流感监测力度。     

活猪携带猪瘟病毒检测方法比较

对2个猪场的母猪血清、扁桃体、全血样品和公猪精液分别应用荧光抗体染色法、RT-PCR、CS-FV抗原ELISA、CSFV糖蛋白Erns ELISA 4种方法进行CSFV对应检测和比较。结果显示,荧光抗体染色法检出率最高,但与其他3种方法存在较大差异,RT-PCR方法检出率和重复性次之;猪瘟抗原ELISA方法检出率第3,重复性第1;CSFV糖蛋白Erns检出率和重复性均最低,但可筛选是否感染猪瘟病毒野毒。在母猪3种样品中扁桃体的检出率最高,全血样品次之,血清检出率最低。4种样品中公猪精液重复性最好,其次是母猪全血样品,母猪扁桃体第3;母猪血清样品最差。     

山羊痘病毒糖蛋白基因ORF112的原核表达及多克隆抗体的制备

为探索山羊痘病毒(GTPV)糖蛋白基因ORF112在疫苗和诊断中的应用,应用PCR技术扩增GTPV弱毒疫苗株AV 41ORF112基因,将其克隆到pET-32a载体,转化感受态细胞BL21,经IPTG诱导后获得与预期大小相符的约37ku的融合蛋白,为可溶性和包涵体表达。应用镍离子亲和树脂对可溶性表达的目的蛋白进行纯化,然后用纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体。免疫荧光试验表明该多克隆抗体可以与GTPV反应,为GTPV新型疫苗和诊断试剂的研究奠定了基础。     

同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。     

A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对SVA 3D基因与O型、A型、亚洲I型FMDV VP1基因,分别设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了同时检测SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法.所建立的方法能特异性扩...     

猪源脑心肌炎病毒GXLC株对小鼠的致病性试验

为研究猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株对小鼠的致病性,将其接种4周龄健康BALB/c小鼠,观察临床症状,检查病理变化,测定心重/体重比值,检测心脏、脑、脾脏组织及血清中病毒含量,检测心脏、脑、脾脏组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平及血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量。结果显示,感染小鼠出现明显的临床症状,感染后第4天开始死亡,第5~7天死亡达到高峰;心脏、脑出现典型的大体病理变化和组织病理学变化,心重/体重比值显著升高、组织病理学炎症分值显著增加;感染后第1天即可在心脏、脑、脾脏及血清中检测到大量病毒,直至第14天仍能检测到病毒;血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量显著升高,心脏、脑、脾脏组织中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平显著上调,而且细胞因子表达的高峰期与出现明显临床症状、严重病理损害及死亡高峰期密切相关。结果表明,猪源EMCV GXLC株对小鼠具有高度致病性,IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎细胞因子在EMCV对小鼠的致病机制中发挥重要作用。     

山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定

本研究旨在通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体.采用PCR方法,克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242 bp的基因片段,以及ORF18～ORF19间1 355 bp的片段.接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂,构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg.然后采用脂质体介导法,将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性.结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7 kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg.该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代,并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同.表明上述区域是GTPV的复制非必需区.     

广西部分地区猪群主要疫病免疫抗体监测和免疫效果分析

从广西5个地市33家养殖场随机采集免疫过猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪瘟(CSF)、猪伪狂犬病(PR)疫苗的血清样品393份,使用免疫胶体金方法对样品的抗体水平进行检测。结果显示,不同养殖规模的猪场抗体阳性率总体较高的是猪瘟,达75.06%;其次是猪伪狂犬病,为71.25%;而猪繁殖与呼吸综合征抗体最低,仅为42.24%。各种病原抗体在不同规模的猪场有较大的差别,规模猪场的猪群某些疫病的抗体未必比散养猪群高。通过对不同类型的疫苗所产生的抗体水平进行比较,结果发现,使用猪繁殖与呼吸综合征灭活苗和弱毒苗、猪瘟脾淋苗和细胞苗、猪伪狂犬病国产苗和进口苗免疫所产生的抗体水平没有明显差异。