2022年湖南省兽医实验室检测能力比对及非洲猪瘟检测能力验证

实验室检测能力比对与能力验证是评估实验室检测质量的重要手段。2022年4月,按照农业农村部关于检测能力比对的工作部署和要求,湖南省组织全省14个市级77个县级兽医系统实验室开展了检测能力比对,267个实验室开展了非洲猪瘟能力验证。市级开展禽流感病毒H5/H7亚型核酸鉴别检测、非洲猪瘟病毒核酸检测、O型口蹄疫病毒抗体检测3个项目,县级开展非洲猪瘟病毒核酸、O型口蹄疫病毒抗体以及布鲁氏菌抗体检测3个项目,非洲猪瘟检测实验室开展非洲猪瘟病毒核酸检测项目,每个项目各5份盲样。结果显示:12个市级和59个县级系统实验室所有比对项目检测结果全部准确,实验室整体准确率为78.02%,1 355份样品中1 317份样品检测结果准确,样品整体准确率为97.20%;267个参加非洲猪瘟能力验证的实验室中,224个实验室核酸检测结果准确,实验室整体准确率为83.90%,1 335份样品中1 265份样品结果准确,样品整体准确率为94.76%,其中屠宰企业样品准确率最低(93.30%)。结果表明:湖南省兽医实验室检测能力整体良好,但部分县级兽医系统实验室及屠宰企业实验室检测能力有待加强。各地应继续加强实验室检...     

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。     

生猪屠宰场非洲猪瘟检测能力比对

为了了解山西省屠宰场非洲猪瘟的检测能力与水平,2019年山西省动物疫病预防控制中心对全省11个市的屠宰场开展了非洲猪瘟病毒检测能力比对。本次比对采用荧光PCR检测方法进行非洲猪瘟病毒核酸检测。结果显示,共有96个屠宰场参与比对工作,其中71个屠宰场检测结果符合要求,符合率为74.0%。比对结果客观地反映了全省屠宰场非洲猪瘟病毒核酸检测能力,表明屠宰场非洲猪瘟病毒核酸检测工作仍存在多方面不足,应该进一步增强检测人员的业务能力,以确保检测结果真实准确。     

平凉市生猪屠宰企业实验室非洲猪瘟检测能力比对结果分析

为了进一步评估生猪屠宰企业非洲猪瘟检测在生猪屠宰“两项制度”落实中发挥的积极作用,提升生猪屠宰企业非洲猪瘟自检能力,落实非洲猪瘟常态化防控措施。2020年平凉市10家生猪屠宰企业先后3次参加了省、市动物疫控机构组织的非洲猪瘟病毒核酸荧光PCR检测能力比对工作。结果显示:3次能力比对结果准确率分别为78%、84%和96.6%,并有逐次提高的趋势,有3家生猪屠宰企业3次非洲猪瘟病毒核酸检测比对结果均符合标准,占屠宰企业总数的30%,有7家生猪屠宰企业在3次比对中结果还不稳定,企业之间比对结果存在差异,对10家生猪屠宰企业3次非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对结果影响因素综合分析结果表明,生猪屠宰企业实验室标准化程度越高、检测人员文化程度越高、屠宰企业管理越严格,非洲猪瘟检测能力比对结果越稳定,准确率越高。     

2019年黑龙江省兽医实验室检测能力比对

2019年黑龙江省动物疫病预防与控制中心对全省13个市（地）、67个县（市、区）的80个兽医实验室开展了检测能力比对，比对项目包括禽流感抗体检测、猪瘟抗体检测、布鲁氏菌抗体检测、非洲猪瘟病毒核酸检测。结果显示，6个市级实验室和14个县级实验室比对结果正确率为100%，禽流感抗体、猪瘟抗体、布鲁氏菌抗体、非洲猪瘟病毒核酸检测项目结果正确率分别为71.2%、97.3%、73.3%、97.0%。比对结果客观反映了全省兽医系统实验室检测能力，提示应进一步加强实验室建设，加大资金投入，提升技术人员业务能力，规范实验室检测流程。     

2019年山东省兽医系统实验室检测能力比对

2019年山东省动物疫病预防控制中心组织全省98个兽医系统实验室开展检测能力比对工作,比对项目包括非洲猪瘟病毒核酸检测、禽流感病毒核酸检测、H5亚型禽流感病毒抗体检测和口蹄疫非结构蛋白抗体检测。比对结果显示:总体实验室正确率为70.41%(69/98),其中市级兽医系统实验室正确率为93.75%(15/16),国家动物疫情测报站正确率为68.75%(11/16),县级兽医系统实验室正确率为65.15%(43/66);非洲猪瘟病毒核酸检测、禽流感病毒核酸检测、H5亚型禽流感病毒抗体检测以及口蹄疫非结构蛋白抗体检测结果正确率分别为87.76%、85.71%、93.88%和97.96%。比对结果提示基层兽医系统实验室应提升检验人员的素质,加大实验室设施设备的投入和管理,结合开展社会化服务来推进实验室建设,确保检测结果客观准确。     

2021年北京市兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对

为客观评价北京市兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测能力水平,2021年北京市动物疫病预防控制中心组织10家区级兽医实验室和7家非洲猪瘟第三方授权实验室开展了非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对试验,并利用箱线图、稳健统计Z比分数、尧敦图等统计方法,对各实验室非洲猪瘟病原学检测结果进行统计分析。结果显示,18家兽医实验室（含北京市动物疫病预防控制中心）中有17家检测结果正确,只有1家实验室的1份盲样检测结果不合格,但部分实验室仍存在检测结果预警情况。建议各实验室持续加强质量控制,提高检测能力和水平。     

基于非洲猪瘟检测对县级兽医实验室升级改造的经验及建议

文章介绍了基于非洲猪瘟检测对望谟县兽医实验室进行升级改造的情况,包括项目基本情况、实验室改造前状态、改造过程、检测能力提升及实验室改造经验与建议,通过新增荧光定量PCR仪等设备,不仅能进行常规动物疫病的抗体检测,还能开展非洲猪瘟病毒的核酸检测.     

2016～2020年内江市兽医实验室检测能力比对结果分析

为确保兽医实验室检测结果的科学性和准确性,内江市市级兽医实验室积极参与全省兽医系统实验室检测能力比对试验。2016～2020年,开展了16个比对项目检测,项目类型包含:禽流感病毒抗体检测、口蹄疫病毒抗体检测、猪瘟病毒抗体检测、禽流感病毒核酸检测、口蹄疫病毒核酸检测、非洲猪瘟病毒核酸检测。结果显示:内江市兽医实验室比对结果 5年的准确率均为100%。结果表明,内江市兽医实验室检测水平较高,稳定性也较好,具备较强实验室检测能力。     

云南省文山壮族苗族自治州首例非洲猪瘟的初步诊断

2019年5月23日,云南省文山壮族苗族自治州砚山县维摩乡散养户饲养的猪发生疑似非洲猪瘟疫情。文山州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室运用PCR核酸检测技术结合临床剖检,对该起疫情进行了初步诊断,并经云南省动物疫病预防控制中心兽医实验室复核,确诊为非洲猪瘟病毒感染。此次非洲猪瘟的临床诊断与PCR检测,为基层实验室非洲猪瘟诊断积累了经验,对非洲猪瘟的早发现、早控制具有积极意义。     

基于E184L基因的非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高度接触性传染病。由于ASFV的感染机制极为复杂,基因型多,至今尚无有效疫苗用于防控,防止该病暴发主要依赖于早期快速诊断和控制。为建立一种高效快速、特异的ASFV检测方法,根据ASFV的E184L基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,建立了检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该方法设计的引物具有高度特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数为0.992,对ASFV核酸最低检测限为1.51拷贝,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等不存在交叉反应。建立的基于ASFV E184L基因实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异地对ASFV核酸进行定量分析,丰富了ASFV的检测方法。     

恒温隔绝式荧光PCR检测非洲猪瘟病毒核酸方法的建立

恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)是一种简便、快速及可使用于现场检测的荧光PCR方法.本研究采用农业农村部推荐的检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸的荧光定量PCR方法的引物和探针,通过对引物、探针、Taq酶等反应体系的优化,建立了基于恒温隔绝式荧光PCR的ASFV检测方...     

非洲猪瘟病毒微芯片荧光PCR快速检测技术的建立及初步应用

非洲猪瘟缺乏安全有效的疫苗,其防控有赖于及时、准确的诊断和消毒灭源。本研究在对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L基因序列进行分析的基础上设计引物、探针,建立了基于微芯片的ASFV免提取荧光PCR检测技术。特异性试验结果显示,微芯片PCR可用于我国不同地区ASFV毒株的通用检测,对其他主要猪源病毒均为阴性;敏感性试验结果显示其检测下限为10拷贝/μL;对117份临床样品的检测结果显示,该方法可用于猪全血、淋巴结、脾脏、肌肉样本中ASFV核酸的检测,与世界动物卫生组织推荐的荧光PCR检测方法相符率达100%,且显著简化了检测操作步骤,检测用时缩短在30 min之内,获得农业农村部第一批非洲猪瘟现场快速检测试剂的推荐,应用于养殖场、屠宰场和流通环节中ASFV核酸的检测。     

Development of Virus-like Particles Containing African Swine Fever Virus Nucleic Acid Sequence and Its Application in Detection Method

African swine fever (ASF) is an infectious disease caused by the African swine fever virus (ASFV). In order to ensure the accuracy and reliability of the test results,it is necessary to develop positive standard control products used in the kit. The study was aimed to develop the virus-like particles containing African swine fever virus (ASFV) nucleic acid sequence and its application in detection method. Fristly,the full-length gene fragment of p72 gene was amplified, and the ASF DNA virus-like particles containing p72 gene was constructed using insect baculovirus system. In order to further validate the reliability of the virus-like particles in the application of the method,DNA nucleic acid was extracted simultaneously with the cultured virus and infected tissue sample and applied in the Real-time quantitative PCR method. The results showed that the virus-like particles prepared by this study could replace the ASFV as a positive control product in the Real-time quantitative PCR method, and could act as quality control during nucleic acid extraction process. In the fluorescent PCR detection kit, the lowest packaging concentration of virus-like particles was 10² TCID₅₀. Further studies had shown that the virus-like particles were also suitable for common PCR and LAMP detection methods, the minimum concentration were 10³ and 10¹ TCID₅₀, respectively. The results of this study would be important for the ASF detection method, promoting the application of the method and ensuring the accuracy and reliability of the test results.     

含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的烈性传染病,为了保证其检测结果的准确性和可靠性,需要研制试剂盒中使用的阳性标准质控品。本试验旨在研制含ASFV核酸序列的病毒样颗粒,并探究其在检测方法中的应用。首先扩增p72基因的全长片段,利用昆虫杆状病毒系统,包装出含有p72基因的ASF DNA病毒样颗粒。为了进一步验证该病毒样颗粒在应用中的可靠性,本研究将病毒样颗粒与ASF的组织毒及细胞毒同时进行DNA核酸提取,进行实时荧光定量PCR。结果表明,本研究制备的病毒样粒子能很好的取代ASFV在实时荧光定量PCR检测方法中作为阳性质控品,且能对核酸提取过程进行质控,实时荧光定量PCR检测试剂盒中,病毒样粒子的最低包装浓度为10² TCID₅₀。进一步研究发现该病毒样颗粒也适用于普通PCR及LAMP检测方法中,最低浓度分别为10³和10¹ TCID₅₀。本试验结果将为规范ASF检测方法,促进ASF检测方法的转化应用及保证检测结果的准确度和可靠性提供科学依据。     

非洲猪瘟病毒核酸检测技术与应用进展

自2018年8月以来,非洲猪瘟已成为我国养猪业的头号疫病,对养猪业造成了巨大损失。基于聚合酶链式反应(PCR)的核酸检测方法具有高灵敏性和高特异性,在对非洲猪瘟的诊断、感染监控和养殖复产过程中生物安全评价等方面发挥了重要的作用。文章对常用的核酸检测技术与特点、非洲猪瘟病毒核酸检测方法的应用、核酸检测新技术展望3个方面进行了总结,以期为养猪企业在非洲猪瘟核酸检测和监测方面提供帮助。     

兽用疫苗中BVDV、PCV2和PPV污染三重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速同时检测兽用疫苗中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)3种病原的方法,通过研究比对BVDV 5'-UTR、PCV2 Rep以及PPV NS1基因序列,分别设计合成了3对引物和3条荧光探针,在优化反应条件和反应程序后,建立了一种可同时检测BVDV、PCV2以及PPV的三重荧光定量PCR方法,并对其敏感性、特异性进行了评估。结果显示,建立的三重荧光定量PCR方法灵敏度高,对3种病原核酸的最低检测限均为10 copies/μL;特异性强,与其他相关病原(猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒)均无交叉反应。结果表明,本试验建立的三重荧光定量PCR适于疫苗中外源病毒的检测,可用于疫苗等生物制品质量把控。     

基于非洲猪瘟病毒标准物质的荧光PCR检测试剂盒初步评价

为探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)标准物质作为试剂盒评价体系的可行性,比较了市场上5种主流品牌ASFV荧光PCR检测试剂盒的检测性能。使用ASFV P72基因核酸标准物质作为模板,根据5种试剂盒说明书分别进行相应的荧光定量PCR检测,结合扩增曲线、Ct值,分析不同试剂盒的敏感性、可重复性以及所需反应时间。结果显示:5种试剂盒的阴性、阳性对照均成立,最低检测限均为5.9×10^-1拷贝/μL;4个厂家的试剂盒线性关系R2>0.98,其中最优的R²=0.994,离散度最小;各试剂盒的实际反应耗时与理论反应耗时均有一定差异(0.20~0.96 h)。结果表明,各生产厂家使用P72基因作为靶基因研制的ASFV荧光PCR检测试剂盒都可以使用ASFV标准物质作为评价体系,来评判试剂盒的检测性能。本试验为各实验室不同样品检测的ASFV荧光PCR检测试剂盒选择提供了一种可用的评价方法。     

非洲猪瘟病毒常规PCR及Real-time PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因的核苷酸序列,设计并合成引物以及荧光标记的TaqMan探针,以含P72基因的重组质粒作为阳性模板,用于常规PCR和Real-time PCR方法的建立,结果表明常规PCR的检测灵敏度是600个拷贝的病毒核酸分子,Real-time PCR的检测灵敏度是20个拷贝的病毒核酸分子,两种PCR检测方法均具有特异性强、简单快速的优点。可以用于出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测。     

一种用于非洲猪瘟病毒检测的PCR方法

基于非洲猪瘟病毒(ASFV)VP72基因设计引物,建立一种检测非洲猪瘟病毒的PCR方法。应用本研究所建立的方法与OIE参考的方法进行比较,并对参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个分离株的基因组以及本实验室收集的野外样品进行检测。结果显示:本研究设计的引物具有良好的特异性,与猪的其他病原没有交叉反应;其敏感性与OIE参考的方法相当;所建立的PCR方法能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个分离株的基因组,野外样品检测均为阴性。根据上述研究结果,本研究所建立的方法具有很好的应用性,能够用于非洲猪瘟疫病的诊断以及防控。