非洲猪瘟病毒K196R基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒定量检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)早期表达基因K196R的基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针浓度,建立了快速检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法选择的引物具有高度灵敏性和特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系(R~2=0.998),对ASFV核酸最低检测下限为1.3拷贝,且与猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应。本研究建立的K196R基因实时荧光定量PCR检测方法为非洲猪瘟疫情提供了一种新型、灵敏和特异的早期检测方法。     

非洲猪瘟病毒检测试剂盒的研制

针对非洲猪瘟病毒（ASFV）P54基因建立荧光PCR检测方法,通过优化引物、TaqMan探针浓度及反应温度,研发了ASFV检测的荧光PCR检测试剂盒。经灵敏度的重复性试验及3种不同型号荧光PCR仪使用验证,所研发的试剂盒灵敏度为101copy/μL,适用于不同型号荧光PCR仪使用,可用于对非洲猪瘟病毒的快速检测。     

非洲猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

建立一种TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)保守结构蛋白P72基因的检测。参照GenBank登录的ASFV P72相关基因序列,设计合成1对特异性引物与1个TaqMan探针,通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ASFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,对该方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,该方法能有效扩增1.0×10~0～1.0×10~9拷贝/μL ASFV-P72标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0×10~0拷贝;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%。结果表明,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于临床样本中ASFV的检测,从而更好地对ASF疫情进行监测和诊断。     

非洲猪瘟病毒常规PCR及Real-time PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因的核苷酸序列,设计并合成引物以及荧光标记的TaqMan探针,以含P72基因的重组质粒作为阳性模板,用于常规PCR和Real-time PCR方法的建立,结果表明常规PCR的检测灵敏度是600个拷贝的病毒核酸分子,Real-time PCR的检测灵敏度是20个拷贝的病毒核酸分子,两种PCR检测方法均具有特异性强、简单快速的优点。可以用于出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测。     

非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)通用型高通量检测技术,利用高度保守的非结构DNA聚合酶G1211R基因,制备质粒标准品,建立实时荧光LAMP方法,出现典型的S形核酸扩增曲线,扩增产物具有特异的熔解曲线。G1211R基因质粒标准品在1.81×10~5拷贝数/μL~1.81×10~9拷贝数/μL对数值与Ct值之间的线性关系良好。以ASFV E70株病毒核酸为模板,LAMP检测灵敏度达到21pg,优于荧光定量PCR方法。重复性试验LAMP检测批内和批间变异系数均小于5%。LAMP方法检测ASFV特异性良好,与猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及昆虫核酸无交叉反应。以ASFV Arm 07株制备各种临床模拟样品,检出阳性率达到17.31%。检测方法的建立,可为非洲猪瘟防控提供新的技术手段,有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查。     

鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在10⁰~10⁶拷贝·μL^-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL^-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测

本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^1范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸,与本实验室建立的RT-套式PCR（RT-nPCR）具有相近的敏感性,二者对152份不同样品检测符合率达94.7%。应用本方法对人工感染10^6TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0-14 d全血中猪瘟病毒RNA进行了定量检测,揭示了猪瘟病毒在猪体内复制的动态变化,证实了感染猪临床表现与病毒滴度存在明显的时间相关性。此外发现,在同居感染猪出现猪瘟临床症状前3-4 d可从其全血中检出病毒RNA。     

非洲猪瘟病毒微芯片荧光PCR快速检测技术的建立及初步应用

非洲猪瘟缺乏安全有效的疫苗,其防控有赖于及时、准确的诊断和消毒灭源。本研究在对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L基因序列进行分析的基础上设计引物、探针,建立了基于微芯片的ASFV免提取荧光PCR检测技术。特异性试验结果显示,微芯片PCR可用于我国不同地区ASFV毒株的通用检测,对其他主要猪源病毒均为阴性;敏感性试验结果显示其检测下限为10拷贝/μL;对117份临床样品的检测结果显示,该方法可用于猪全血、淋巴结、脾脏、肌肉样本中ASFV核酸的检测,与世界动物卫生组织推荐的荧光PCR检测方法相符率达100%,且显著简化了检测操作步骤,检测用时缩短在30 min之内,获得农业农村部第一批非洲猪瘟现场快速检测试剂的推荐,应用于养殖场、屠宰场和流通环节中ASFV核酸的检测。     

鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪瘟病毒(CSFV)野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5′UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示:建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在10~0～10~6拷贝·μL~(-1)模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%～2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL~(-1);利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。     

恒温隔绝式荧光PCR检测非洲猪瘟病毒核酸方法的建立

恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)是一种简便、快速及可使用于现场检测的荧光PCR方法.本研究采用农业农村部推荐的检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸的荧光定量PCR方法的引物和探针,通过对引物、探针、Taq酶等反应体系的优化,建立了基于恒温隔绝式荧光PCR的ASFV检测方...     

非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价

根据非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）K205R基因序列设计合成引物及TaqMan探针,通过优化引物浓度、退火温度和Mg²⁺浓度,建立基于K205R基因的ASFV实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）检测方法。对在猪肝脏组织DNA中掺入重组质粒制备的模拟样品进行扩增来确定所建方法的实际检测效率,并将OIE推荐的基于p72的qPCR调整后作为评价该方法检测效果的对照。试验结果表明,基于K205R基因的检测方法在检测模拟样品时扩增效率要优于基于p72的方法,而且敏感性和特异性强,适用于非洲猪瘟的快速检测、监测。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列,设计了一对特异性引物和探针,使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法。结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性。     

兽用疫苗中BVDV、PCV2和PPV污染三重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速同时检测兽用疫苗中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)3种病原的方法,通过研究比对BVDV 5'-UTR、PCV2 Rep以及PPV NS1基因序列,分别设计合成了3对引物和3条荧光探针,在优化反应条件和反应程序后,建立了一种可同时检测BVDV、PCV2以及PPV的三重荧光定量PCR方法,并对其敏感性、特异性进行了评估。结果显示,建立的三重荧光定量PCR方法灵敏度高,对3种病原核酸的最低检测限均为10 copies/μL;特异性强,与其他相关病原(猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒)均无交叉反应。结果表明,本试验建立的三重荧光定量PCR适于疫苗中外源病毒的检测,可用于疫苗等生物制品质量把控。     

Establishment of a Real-time Fluorescent Recombinase Polymerase Amplification (RPA) for the Detection of African Swine Fever Virus

African swine fever (ASF), which caused by African swine fever virus (ASFV), is an acute, highly contagious disease characterized by high fever. It leads to serious economic losses in pig industry. 3 assemblies of primers and probes targeting were designed to amplify ASFV B646L (p72) gene using recombinase polymerase amplification (RPA) technology. The Real-time fluorescent RPA method was established after screening of primers and probes, optimization of reaction conditions, tests of sensitivity, specificity and repeatability. The results showed that the method could detect 10 copies of DNA within 20 min at 39℃. No cross-reaction was found when testing swine fever virus, porcine circovirus type 2, porcine parvovirus, pseudorabies virus. According to the fluorescence intensity from 5.5×10⁶ to 5.5×10⁰ copies/μL at each time point, the coefficient of variation was 0.38% to 28.30%. In conclusion, this method could be used for the qualitative detection of ASFV pathogen, which might provide technical support for the early diagnosis of ASFV infection in China, and was also of great significance for the development of corresponding control measures.     

非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）,针对ASFV B646L （p72）基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×10⁶至5.5×10⁰拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究为了建立一套检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的23株编码ASFV结构蛋白p72的基因序列,设计引物和探针,优化退火温度、Mg^2＋浓度和引物、探针浓度,生成标准曲线,进行重复性、敏感性、特异性试验,并检测样品。结果显示,优化的退火温度为60 ℃,Mg^2＋终浓度为4 mmol/L,引物、探针终浓度分别为0.8、0.3 μmol/L。重复性试验变异系数均小于1.3%,敏感性试验最低能够检测到10拷贝/μL的质粒,以其他5种猪病病毒和ASFV质粒为模板进行特异性试验,只有ASFV质粒出现扩增曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法是快速、灵敏、特异的检测ASFV的方法。