非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了研究检测非洲猪瘟病毒的方法,试验采用GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列设计了1对特异性引物和探针,并使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法.结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性.     

非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法的建立

建立一种具有高灵敏度的检测非洲猪瘟病毒的微滴数字PCR方法,为非洲猪瘟的快速诊断和流行病学研究提供技术支持。在《OIE陆生动物诊断与疫苗手册》中提供的qPCR检测方法的基础上,建立了非洲猪瘟病毒微滴数字PCR方法,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法的最低检测限可达0.8copies/μL,敏感性高于qPCR方法,不与猪常见的6种病毒发生交叉反应,而且重复性较好。采用建立的微滴数字PCR和OIE的qPCR方法分别对78份临床病料进行非洲猪瘟病毒的检测,结果显示2种方法的符合率为100%。本研究建立的微滴数字PCR方法具有理想的敏感性和特异性,适用于临床上非洲猪瘟病毒的检测。     

基于非洲猪瘟病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法

为了建立一种能够检测非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性抗体的单抗阻断ELISA方法，本试验首先构建了非洲猪瘟病毒p30蛋白的原核表达载体，进而制备并筛选出1株能特异性识别p30蛋白的高亲和力单克隆抗体，采用昆虫杆状病毒表达系统Bac-to-Bac进行该单克隆抗体的表达。以p30重组蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体作为阻断抗体建立了一种非洲猪瘟病毒特异性抗体的检测方法，并验证其敏感性、特异性以及与商品化试剂盒的符合率。结果显示，该方法敏感性为100%,特异性为100%,与商品化试剂盒比较，符合率为98.7%。结果表明，本试验基于非洲猪瘟病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法敏感性好、特异性强，结果准确可靠，可用于非洲猪瘟病毒抗体检测。     

非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用

本研究基于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）vp72基因设计引物,建立了能够快速检测非洲猪瘟病毒的环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。将LAMP与OIE参考的PCR检测方法进行比较,并且应用LAMP对非洲猪瘟参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组以及国内收集的50份猪的基因组、30份蜱的基因组进行检测。结果显示,本研究设计的引物具有良好的特异性和敏感性,所建立的LAMP能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组,而野外收集的猪和蜱的基因组检测均为阴性。因此,本研究所建立的方法能够用于非洲猪瘟的快速诊断以及防控。     

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。     

非洲猪瘟血清学诊断和疫苗研究进展

非洲猪瘟是一种高度接触性猪传染病,自2018年8月传入我国后呈暴发性流行,目前防控形势依然严峻。因此,开发准确、快速的检测方法和安全、高效的疫苗具有重要意义。由于非洲猪瘟病毒复杂的生物学特性阻碍了疫苗的研发,目前尚无批准上市的商品化疫苗。理论上健康猪只体内不存在非洲猪瘟病毒抗体,血清学检测具有高度的敏感性和特异性,如果检测到抗体反应阳性,即提示猪场出现了感染。论文综述了非洲猪瘟的各种血清学检测方法,以及灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和病毒活载体疫苗的研究进展,以期为非洲猪瘟的诊断和疫苗的研发提供借鉴。     

非洲猪瘟病毒检测技术研究进展

自2018年我国发生首例非洲猪瘟疫情以来,疫情迅速蔓延至我国的31个省份。随着疫情的发展,快速检测非洲猪瘟病毒技术成为养殖企业及时发现和防控非洲猪瘟疫情的一个手段。本文从非洲猪瘟病毒的核酸检测技术、完整病毒颗粒检测技术和抗体检测方法等3方面论述了当前我国在非洲猪瘟病毒检测方面的技术和方法。并列举了当前国内非洲猪瘟病毒诊断制品的注册批准情况,以期为养猪企业在排查（检测）非洲猪瘟病毒、选择诊断试剂方面提供参考。     

一种用于非洲猪瘟病毒检测的PCR方法

基于非洲猪瘟病毒(ASFV)VP72基因设计引物,建立一种检测非洲猪瘟病毒的PCR方法。应用本研究所建立的方法与OIE参考的方法进行比较,并对参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个分离株的基因组以及本实验室收集的野外样品进行检测。结果显示:本研究设计的引物具有良好的特异性,与猪的其他病原没有交叉反应;其敏感性与OIE参考的方法相当;所建立的PCR方法能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个分离株的基因组,野外样品检测均为阴性。根据上述研究结果,本研究所建立的方法具有很好的应用性,能够用于非洲猪瘟疫病的诊断以及防控。     

非洲猪瘟病毒及诊断技术研究进展

非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员,病毒基因组庞大,能编码100种以上的蛋白质分子。20世纪20年代该病毒首次在非洲的肯尼亚被发现,经过几十年,已经在世界多个国家不断蔓延,我国于2018年8月首次发生非洲猪瘟疫情。目前,非洲猪瘟抗原检测方法有红细胞吸附试验、荧光抗体试验、PCR技术、荧光定量PCR技术、环介导等温扩增技术等。抗体检测技术主要是酶联免疫吸附试验、胶体金试纸条法等。根据非洲猪瘟疫情在我国的发生情况,中国动物疫病预防控制中心组织了非洲猪瘟现场快速检测评审,对各种检测方法进行了技术把关,为非洲猪瘟病毒的检测和防控提供了技术保证。     

非洲猪瘟病毒核酸定性检测方法比对

为提升兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测能力和质量控制水平,积累检测经验,以更好地开展非洲猪瘟检测,2020年7月,参加了北京市农业农村局组织的“非洲猪瘟实验室检测能力比对”项目。本次比对同时选用《非洲猪瘟检疫技术规范》(SNT 1559—2010标准)中的普通PCR方法、荧光定量PCR方法以及商品化试剂盒,对5份验证样品开展非洲猪瘟病毒核酸检测和结果比对。比对发现,3种检测方法结果一致,样品检测结果与预期一致,结果满意。此次比对确认了实验室现有检测方法能够满足非洲猪瘟病毒核酸的日常检测需求,同时提升了实验室人员的检测能力,积累了检测经验,可为非洲猪瘟防控提供有力的技术支撑。     

基于E184L基因的非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高度接触性传染病。由于ASFV的感染机制极为复杂,基因型多,至今尚无有效疫苗用于防控,防止该病暴发主要依赖于早期快速诊断和控制。为建立一种高效快速、特异的ASFV检测方法,根据ASFV的E184L基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,建立了检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该方法设计的引物具有高度特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数为0.992,对ASFV核酸最低检测限为1.51拷贝,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等不存在交叉反应。建立的基于ASFV E184L基因实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异地对ASFV核酸进行定量分析,丰富了ASFV的检测方法。     

非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立

非洲猪瘟给全球养猪业造成了严重危害,需要建立更加敏感的PCR检测方法。根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的VP72基因序列,设计PCR引物,建立了ASFV PCR检测方法。以合成的VP72基因片段为阳性对照,进行敏感性试验和特异性试验。同时与世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR引物进行对比试验。结果显示,建立的方法可用于ASFV检测,且对其他病毒检测时无交叉反应,特异性良好;敏感性可达到10-8,比OIE推荐的方法高10倍,为ASFV检测提供了一种新的PCR方法。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术（LAMP）建立了一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的方法。整个反应在水浴锅中恒温进行,不需要其他昂贵仪器,30 min即可得到阳性结果,灵敏度是OIE标准PCR方法的100倍,并且与其他常见猪DNA病毒无交叉反应。该方法非常适合在野外现场或缺乏试验条件的边远地区检测非洲猪瘟病毒。     

用PCR技术快速检测非洲猪瘟病毒

选择编码非洲猪瘟病毒结构蛋白ＶＰ７３的部分基因片段为模板，用ＰＣＲ技术检测非洲猪瘟病毒ＤＮＡ，电泳分离可见１条长约１ｋｂ的ＤＮＡ扩增带。本方法具有安全、快速、敏感等特点     

Development of Virus-like Particles Containing African Swine Fever Virus Nucleic Acid Sequence and Its Application in Detection Method

African swine fever (ASF) is an infectious disease caused by the African swine fever virus (ASFV). In order to ensure the accuracy and reliability of the test results,it is necessary to develop positive standard control products used in the kit. The study was aimed to develop the virus-like particles containing African swine fever virus (ASFV) nucleic acid sequence and its application in detection method. Fristly,the full-length gene fragment of p72 gene was amplified, and the ASF DNA virus-like particles containing p72 gene was constructed using insect baculovirus system. In order to further validate the reliability of the virus-like particles in the application of the method,DNA nucleic acid was extracted simultaneously with the cultured virus and infected tissue sample and applied in the Real-time quantitative PCR method. The results showed that the virus-like particles prepared by this study could replace the ASFV as a positive control product in the Real-time quantitative PCR method, and could act as quality control during nucleic acid extraction process. In the fluorescent PCR detection kit, the lowest packaging concentration of virus-like particles was 10² TCID₅₀. Further studies had shown that the virus-like particles were also suitable for common PCR and LAMP detection methods, the minimum concentration were 10³ and 10¹ TCID₅₀, respectively. The results of this study would be important for the ASF detection method, promoting the application of the method and ensuring the accuracy and reliability of the test results.     

含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的烈性传染病,为了保证其检测结果的准确性和可靠性,需要研制试剂盒中使用的阳性标准质控品。本试验旨在研制含ASFV核酸序列的病毒样颗粒,并探究其在检测方法中的应用。首先扩增p72基因的全长片段,利用昆虫杆状病毒系统,包装出含有p72基因的ASF DNA病毒样颗粒。为了进一步验证该病毒样颗粒在应用中的可靠性,本研究将病毒样颗粒与ASF的组织毒及细胞毒同时进行DNA核酸提取,进行实时荧光定量PCR。结果表明,本研究制备的病毒样粒子能很好的取代ASFV在实时荧光定量PCR检测方法中作为阳性质控品,且能对核酸提取过程进行质控,实时荧光定量PCR检测试剂盒中,病毒样粒子的最低包装浓度为10² TCID₅₀。进一步研究发现该病毒样颗粒也适用于普通PCR及LAMP检测方法中,最低浓度分别为10³和10¹ TCID₅₀。本试验结果将为规范ASF检测方法,促进ASF检测方法的转化应用及保证检测结果的准确度和可靠性提供科学依据。     

某养殖场的病死野猪ASFV实时荧光PCR检测

为了进一步做好非洲猪瘟疫情防控工作,研究用实时荧光PCR法对武威市某养殖场病死野猪的猪耳朵和猪鼻拭子样品进行了非洲猪瘟病毒检测。结果显示该养殖场病死猪耳样品和猪鼻拭子样品均无Ct值,线形为直线,表明所有被检测样品均为ASFV抗原阴性。研究为严防非洲猪瘟进入威武市奠定了坚实的技术储备,也为威武市非洲猪瘟疫情防控提供了一定参考。     

非洲猪瘟病毒核酸检测技术与应用进展

自2018年8月以来,非洲猪瘟已成为我国养猪业的头号疫病,对养猪业造成了巨大损失。基于聚合酶链式反应(PCR)的核酸检测方法具有高灵敏性和高特异性,在对非洲猪瘟的诊断、感染监控和养殖复产过程中生物安全评价等方面发挥了重要的作用。文章对常用的核酸检测技术与特点、非洲猪瘟病毒核酸检测方法的应用、核酸检测新技术展望3个方面进行了总结,以期为养猪企业在非洲猪瘟核酸检测和监测方面提供帮助。