非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。     

布氏杆菌微滴数字PCR方法的建立

为建立一种布氏杆菌微滴数字PCR qPCR方法,对布氏杆菌病的定量诊断提供技术支持,在实时荧光PCR (qPCR)检测方法(T/CVMA 20-2020)的基础上,建立了布氏杆菌微滴数字PCR方法,并对方法的反应条件进行了优化,同时对其敏感性、特异性、重复性进行了评估.结果 显示:本方法的最低检测下限为2.6 copi...     

猪瘟病毒微滴式数字PCR方法的建立

为建立猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,实现猪瘟病毒定量检测。本研究根据猪瘟病毒5’UTR基因的保守序列设计了引物探针,对反应条件进行了优化,同时对该方法的灵敏性、特异性、重复性进行了评估,并对临床样品进行了检测。结果显示:本方法的最低检测下限为3.2copies/μL,未发现与其他病毒有交叉反应,样本重复的变异系数为3.9%,对临床样品的检测结果与实时荧光定量PCR(GB/T 27540-2011)的检测结果完全一致。本研究建立的猪瘟病毒微滴式数字PCR灵敏度高、特异性强、重复性好,适用于猪瘟病毒的临床检测。     

非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法建立

为建立一种快速、准确的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,以2018年8月分离的SY18毒株P72基因序列(GenBank登录号:MH713612.1)为参考毒株,人工合成质粒标准品,命名为pcDNA3-P72,基于该毒株P72基因序列,在1627~1876 bp处设计一对特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系及条件,本研究成功建立了基于P72基因的TaqMan探针qPCR方法,并与OIE的特异性引物和TaqMan探针进行灵敏度、稳定性和特异性比较.结果显示:本研究建立的qPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R^2值可达到0.9932,灵敏性最低能检测到10 copies/μL,与OIE引物扩增灵敏度相当,比普通PCR方法高100倍.该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%.这一方法为我国非洲猪瘟疫情的快速确诊提供了必要的分子诊断工具.     

水貂犬瘟热病毒微滴数字PCR检测方法的建立与应用

为建立检测水貂犬瘟热病毒(mink canine distemper virus, CDV)的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量方法，以便提供水貂CDV在诊断检测方面的技术支持，本研究根据实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法原理，建立了水貂CDV数字PCR方法，并优化了反应条件，评估了特异性、敏感性以及重复性。结果表明：ddPCR方法检测CDV的最适引物浓度为900 nmol/L,探针浓度为250 nmol/L,退火温度为55℃,升降温度为2.5℃/s,最低检测下限为4.4拷贝/μL;除CDV特异性扩增，其他常见病毒特异性检测结果均为阴性；重复性试验的变异系数均小于5%。采用该微滴数字PCR和荧光定量RT-PCR方法对30份犬、貂、狐、貉等组织(其中CDV阳性样品7份)样品进行检测，检测结果与临床检测结果相符。本研究建立的微滴数字PCR方法对CDV定量检测特异性强、灵敏度高，重复性好，可以用于水貂CDV临床样品的核酸检测，对水貂CDV发病早期的诊断提供新的定量检测方法。     

鸡细小病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可定量检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus, ChPV)的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)新型检测方法。引物设计参考了GenBank中ChPV的NS基因保守序列，筛选了特异性探针引物组，采用不同探针引物浓度组合和退火温度梯度对反应条件进行优化，并通过使用该方法与荧光定量PCR(qPCR)和普通PCR方法进行灵敏度比较，同时对其他常见禽病病原体进行检测，以及对40份临床样品进行检测，评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示，该方法最佳引物浓度均为900 nmol/L,最佳探针浓度为600 nmol/L;最佳退火温度为54.0℃;灵敏度比qPCR和普通PCR分别高10倍和1000倍，最低检测限为4.5 copies/μL;对其他常见禽病病原体进行ChPV微滴式数字PCR检测，结果均为阴性；批内和批间重复性较好，变异系数小。结果表明，所建立的ddPCR方法具有更高的敏感性和准确性，可成功用于快速定量检测ChPV感染。     

一种用于非洲猪瘟病毒检测的PCR方法

基于非洲猪瘟病毒(ASFV)VP72基因设计引物,建立一种检测非洲猪瘟病毒的PCR方法。应用本研究所建立的方法与OIE参考的方法进行比较,并对参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个分离株的基因组以及本实验室收集的野外样品进行检测。结果显示:本研究设计的引物具有良好的特异性,与猪的其他病原没有交叉反应;其敏感性与OIE参考的方法相当;所建立的PCR方法能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个分离株的基因组,野外样品检测均为阴性。根据上述研究结果,本研究所建立的方法具有很好的应用性,能够用于非洲猪瘟疫病的诊断以及防控。     

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的建立

依据非洲猪瘟病毒(ASFV)的vp73基因保守序列,设计了特异性引物与TaqMan探针,扩增片段69bp,建立了ASFV实时荧光PCR检测方法。与OIE推荐用于检测ASFV的实时荧光PCR和普通PCR方法进行比对,结果显示,本文建立的方法与OIE两种检测方法的特异性相当,灵敏度与OIE荧光PCR方法相当,但比普通PCR方法高出至少10倍。标准定量曲线显示,本文方法最低检测限可达10 copies/μL病毒DNA(相关系数为0.993046)。重复性试验的批内CV值为0.61%～1.14%,批间CV值为1.37%～3.14%,表明本文方法的重复性和稳定性良好。可见,本文建立的基于vp73基因的ASFV实时荧光PCR检测方法具备快速、准确、灵敏的特点,将为检验检疫部门防御ASFV传入我国提供更多技术支持。     

H7亚型禽流感病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

为了建立灵敏、特异的H7亚型禽流感病毒(AIV)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法，本研究根据GenBank和GISAID中H7亚型AIV血凝素(HA)基因的核苷酸序列，设计合成H7亚型AIV的引物和探针，对反应条件进行优化，从而建立检测H7亚型AIV的ddPCR方法，并测定其特异性、敏感性和重复性。结果显示，最佳引物浓度和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃,最佳升降温速率为2.0℃/s,最佳反转录时间为20 min。特异性试验结果显示，该方法仅对H7亚型AIV进行特异性检测，对H5亚型AIV、H9亚型AIV、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒均不能检出。敏感性试验结果显示，该方法对重组质粒标准品检测下限为0.8 copies/μL,比荧光定量PCR(qPCR)方法敏感性高10倍。组内和组间重复性试验结果显示，变异系数均小于3%。对60份临床样品检测显示，该方法与鸡胚分离方法的符合率为100%。结果表明，本研究建立的H7亚型AIV ddPCR检测方法具有较好的特异性、重复性和敏感性，可用于H7亚型AIV的早期诊断、流行病学...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株国家核酸标准物质的研制

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株国家核酸标准物质,将PRRSV欧洲株代表毒株LV接种Marc145细胞,待出现细胞病变后,反复冻融收集病毒液,并灭活分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、数字PCR法定值、不确定度分析和临床试用。结果显示,制备的标准物质的定值为(1.83±0.22)×10~4 copies/μL;样品均匀;-20℃稳定保存12个月以上,4℃稳定2个月以上。经全国标准物质管理委员会的专家评审,该制备物达到了国家二级标准物质的要求,可以作为核酸扩增检测的PRRSV核酸标准物质。     

犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异性和灵敏性良好,最低核酸检出量为2拷贝·μL^-1,其敏感性比常规PCR高1000倍。分别采用纳米PCR和常规PCR,对广西、北京、吉林送检的75份疑似CPV的临床样品进行检测,CPV阳性率分别为89.3%(67/75)和70.7%(53/75),表明该方法具有更高的敏感性,适用于CPV低含量临床样品的检测。本方法的建立为CPV感染的早期快速、灵敏、准确的诊断提供了新方法,为CPV的防控奠定基础,具有重大的临床应用意义和价值。     

猪圆环病毒3型感染的流行情况与检测方法研究进展

猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)是猪群中流行的一种新型猪圆环病毒。2016—2017年,世界范围陆续报道在猪群中发现PCV3,包括美国、中国、美国、韩国、巴西、波兰和意大利等。PCV3感染多见于具有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍症状的猪群,目前病毒尚未分离成功。本文综述了已报道的PCV3在世界范围内的流行情况,介绍了当前研究的PCV3分子和血清学诊断方法。     

枯草芽孢杆菌制剂对长大母猪生产性能效应试验

选择2~8胎、健康的妊娠30 d长大母猪60头,按随机区组分为2组,每组30头。试验从母猪妊娠30 d开始至哺乳仔猪28 d断奶结束。对照组饲喂基础饲粮,试验组妊娠母猪、哺乳母猪饲喂基础饲粮+0.1%枯草芽孢杆菌制剂。结果表明,妊娠母猪总产仔数、产活仔数、初生窝重、初生个体重分别较对照组提高13.47%、8.83%、9.66%、0.61%(P>0.05);28日龄断奶窝重、断奶个体重、断奶仔猪日增重、断奶成活率分别较对照组提高13.93%、6.54%、10.62%、1.74%(P>0.05),仔猪腹泻率降低45.94%(P<0.05)。妊娠期母猪日均采食量增加6.40%(P>0.05),日均粪便重量减少8.43%(P<0.05),粪便pH降低5.56%(P>0.05);哺乳期母猪日均采食量提高5.23%(P>0.05),日均粪便重量减少11.84%(P<0.05),粪便pH降低6.77%(P>0.05)。该试验表明,枯草芽孢杆菌制剂可提高母猪生产力水平、饲料转化率及哺乳仔猪健康。     

牛奶的中红外光谱相关变量遗传参数估计

旨在探究牛奶原始中红外光谱相关变量的遗传规律。本研究收集北京三元绿荷某牛场1 822头荷斯坦牛生产性能测定数据、中红外光谱数据和系谱数据,使用R语言(v3.51)、SAS(v9.2)、DMU(v6.0)等软件进行主成分分析和遗传参数估计,遗传参数估计使用的动物模型考虑了测定月份、胎次和泌乳天数的固定效应及个体加性遗传效应、永久环境效应的随机效应。结果表明,80%以上中红外光谱变量之间的相关系数达0.500～1.000,且3 574～3 521 cm^-1和3 630～3 618 cm^-1区域的变量变异程度较高。对中红外光谱的每个波数进行遗传参数估计,大部分波数的遗传力集中于0.010～0.030之间,处于中高遗传力的波数占比约为7%;随遗传力提高,吸光度增大、透射率降低,且变异系数降低。中红外光谱数据可用于探究牛奶成分的遗传规律,从遗传角度提高奶牛质量,为种牛选择提供参考。     

禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为满足禽流感病毒高通量快速检测的需要,建立了一种能够检测各亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评估,使用该方法与农业行业标准NY/T772—2013中的禽流感病毒RT-PCR方法同时进行临床样品检测。结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4 ng/μL,与传统的RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本方法能实现对禽流感病毒的安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量检测,从而弥补了现有传统检测技术的不足。     

贮存时间对小麦和玉米青贮质量的影响

本研究旨在评价贮存时间对玉米和小麦青贮过程质量的影响。试验选择的原料为玉米和开花期及乳熟期小麦,将其放入1.5 L厌氧发酵罐重,分别发酵1周、2周、1个月、3个月、6个月和1年。贮存一年后,青贮玉米的干物质和中性洗涤纤维消化率显著下降(P <0.05)。干物质产量在贮存3个月后达到最大值(P <0.05)。开花期小麦pH随着贮存时间的延长而降低,乳酸含量在贮存3个月后最高(P <0.05),之后显著降低(P <0.05)。乳熟期小麦pH随贮存时间的升高而降低,乳酸含量在贮存3个月后最高(P <0.05),之后显著降低(P <0.05)。乙酸含量随着贮存时间升高而升高(P <0.05)。贮存时间显著影响青贮玉米干物质、干物质产量、乙酸、中性洗涤纤维消化率及CO_2产量(P <0.05),显著影响开花期小麦pH及CO_2产量(P <0.05),显著影响乳熟期小麦pH、干物质、灰分、乙酸含量、CO_2产量、中性洗涤纤维含量及干物质消化率(P <0.05)。玉米、开花期小麦和乳熟期小麦干物质的损失在3～6个月达到最大水平。乳酸在青贮1～3个月达到最大值,而乙酸则随贮存时间的升高而升高,这也是青贮料好氧稳定性随着时间的增加而升高的原因。     

2018年全球口蹄疫流行状况分析

据世界动物卫生组织(OIE)和世界口蹄疫参考实验室(WRLFMD)样品检测报告,2018年全球共有50多个国家或地区报告发生口蹄疫疫情或检测到口蹄疫病毒。在亚洲、非洲,口蹄疫继续呈地方性或暴发流行,在欧洲(如俄罗斯和土耳其)及南美洲(哥伦比亚)的部分国家呈散发性流行。本文介绍了2018年全球口蹄疫发生情况,分析总结了全球口蹄疫流行特点,简述了全球防控进展,同时结合我国口蹄疫流行情况,对我国口蹄疫防控提出了相关建议。     

小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法的建立

通过优化大肠埃希菌密码子、优化表达条件等方法,在大肠埃希菌表达系统中成功获得了可溶性的N蛋白与NH融合蛋白。进一步基于纯化的可溶性N蛋白与NH融合蛋白建立了小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法。该方法敏感性高,特异性强,能够特异性的检测羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体,与其他相关疫病病原无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。对292份临床血清样品进行检测,与法国IDVET竞争ELISA试剂盒比较,阳性样品符合率为92.47%,阴性样品符合率为97.26%,总的符合率为94.86%。该方法与传统的ELISA方法相比,具有敏感性、特异性相当,操作简单、快速,具有较高的推广应用价值。     

瓜尔豆胶作为饲料添加剂在推水养殖模式下氮磷收支

本试验旨在研究对比添加0.3%的瓜尔豆胶饲料(DJ)及普通饲料(PT)在推水养殖模式下的氮磷收支和养殖效果。试验期为120 d。结果表明,在推水养殖模式下,两种饲料对鱼类生长均无显著影响。且添加瓜尔豆胶还能减少氮磷排放量,减轻对养殖水体的污染。对比两个池塘,在氮磷输入方面,饲料是主要来源,PT输入氮286.88 kg、输入磷74.25 kg,分别占总输入的76.0%、88%;DJ输入氮290.94 kg、输入磷86.41 kg,分别占总输入的74%、88%。PT通过鱼输入氮87.0 kg、输入磷8.38 kg,分别占总输入的23%、10%;DJ通过鱼输出氮96.8 kg、输入磷7.36 kg,分别占总输入的25%、8%。而在氮磷输出方面,PT吸排污输出氮141.5 kg、输出磷47.35 kg,分别占总输出的40%和60%。DJ吸排污输出氮189.57 kg、输出磷63.13 kg,分别占总输出的60%和76%,在吸排污方面,两组之间差异显著(P <0.05)。可以看出添加瓜尔豆胶后会明显改善饲料及肠道排泄物在水中的稳定性,降低对环境的污染。试验结束后通过肠道切片观察养殖周期投喂饲料对肠道组织是否有影响。通过观察饲料对肠道的损伤情况,可以看出,喂食两种饲料的鱼肠道均呈现完好状态,前肠绒毛形状完整,整齐地伸入肠腔内,未发现绒毛破损、肿胀、脱落、表皮细胞水肿充血等症状。