禽肾炎病毒与鸡细小病毒双重PCR检测方法的建立

为了同时检测禽肾炎病毒(avian nephritis virus,ANV)和鸡细小病毒(chicken parvovirus,ChPV),根据GenBank中ANV的ORF基因和ChPV的NS1基因的保守序列,设计筛选了扩增片段大小分别为511 bp和242 bp的特异性引物,通过反应条件优化、特异性和敏感性试验,建立了一种双重PCR检测方法。该方法最佳引物比例为ANV上下引物各0.4μL(20 mol/L),ChPV上下引物各0.6μL(20 mol/L);最佳退火温度为53.8℃;灵敏度可达到55 fg(ANV)和58 fg(ChPV);对常见鸡病病原体进行检测,结果全为阴性。本研究建立的PCR方法具有特异、敏感、快速、稳定的优点,可用于同时鉴别诊断ANV和ChPV的混合感染。     

禽呼肠病毒感染对SPF鸡外周血T细胞亚型变化和细胞因子转录的影响

为探讨禽呼肠病毒(ARV)对SPF鸡外周血淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞数量变化和细胞因子mRNA转录水平的影响,利用流式细胞术和实时荧光定量PCR方法分别测定了ARV感染后1、7、14、21、28、35d感染组和对照组SPF鸡外周血淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞含量和细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α基因mRNA相对转录时相。流式细胞术检测结果表明,SPF鸡感染ARV后7d和14dCD4+、CD8+T细胞比值高于对照组,其中感染7d,CD8+T细胞含量差异显著(P0.05);感染后1、21、28、35d感染组CD4+、CD8+T细胞比值均低于对照组,感染1d后CD4+、CD8+T细胞含量均差异显著(P0.05),说明外周血T细胞亚型变化是ARV感染的重要表现之一。实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,感染组外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-6(除7d外)、IL-18(除14d外)和TNF-α在整个感染过程中表达上调,IL-17和IFN-γ除感染1d外,均表达下调,说明IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α均参与了ARV的感染进程。     

禽呼肠病毒感染鸡胚成纤维细胞后Toll样受体mRNA转录水平的动态变化

为分析禽呼肠病毒(ARV)标准毒株S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)后对相关鸡Toll样受体(ChTLRs)mRNA转录水平的影响作用,利用实时荧光定量PCR,测定和分析ARV-S1133感染CEF后ARV结构蛋白σC和ChTLRs的mRNA转录水平变化情况。结果表明,ARV-S1133感染CEF 10h后,ARVσC蛋白的mRNA相对表达量开始迅速上升,在48h达到峰值;同时,感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21mRNA表达量发生显著变化,在感染72h内各个受体的mRNA表达量呈波浪式变化。5个不同滴度的ARV感染CEF 24 h后,ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21mRNA转录水平与病毒滴度均呈正线性相关。上述结果表明,ARV感染后可诱导CEF ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA转录水平发生变化,可能与禽呼肠病毒的复制和致病机制相关。     

Ⅰ群禽腺病毒双价油乳剂灭活苗的研究

【目的】提高国内I群禽腺病毒疫苗的防控能力,防止I群禽腺病毒蔓延。【方法】优化I群禽腺病毒的增殖条件,以I群禽腺病毒血清4型(FAV-4)及血清8型(FAV-8)的抗原液制备油乳剂单价及双价灭活苗,比较甲醛及β-丙内酯(BPL)的灭活效果,并检验疫苗性状、监测免疫抗体水平及进行免疫攻毒试验和田间试验。【结果】疫苗灭活以1.00mL/L终浓度的甲醛或0.500mL/L终浓度的BPL为宜;3种疫苗均为白色状乳液,4°C下保存期均可达12个月,单价疫苗的最小免疫剂量为100μL/羽,双价疫苗的最小免疫剂量为250μL/羽;免疫抗体水平监测结果表明,免疫后第4周抗体水平达到峰值,且在免疫后第8周仍维持较高水平;免疫攻毒试验结果显示,3种疫苗的保护率均为100%,能完全抵抗病毒攻击;田间试验结果表明,在免疫初期3种疫苗抗体均达到预期免疫效果,免疫保护期在6个月以上,在生产中使用双价疫苗可以减少注射次数。【结论】FAV-4、FAV-8双价油乳剂灭活苗免疫效果好、保存期长、安全性好,为净化I群禽腺病毒提供了技术支撑。     

I群禽腺病毒间接33K-ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种鉴别I群禽腺病毒（FAVI）灭活苗免疫和野毒感染的检测方法，为FAVI的防控与净化提供技术支撑。【方法】以FAVI 33K重组蛋白为包被抗原，筛选和优化间接ELISA的条件，建立FAVI抗体的间接33K-ELISA检测方法，检验其特异性、敏感性和重复性，并鉴别检测FAVI活病毒感染血清和灭活苗免疫血清各50份。【结果】33K重组抗原最佳包被浓度6.0 μg/mL，包被条件为37℃孵育1 h后4℃过夜，最佳封闭液为5%脱脂奶，封闭时间1.0 h；待检血清稀释度1∶100，抗原抗体最佳作用时间1.0 h；酶标二抗最佳稀释度1∶3000，作用时间45 min。优化后的间接33K-ELISA的阴、阳性临界值为0.316。其特异性、敏感性、重复性试验及鉴别检测结果表明，优化后的间接33K-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，且能成功鉴别FAVI感染与灭活疫苗接种。【结论】间接33K-ELISA操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好、适于批量检测，可有效鉴别FAVI感染和灭活苗免疫接种，利于挑选出FAVI感染动物，为FAVI的防控与净化提供了新思路和新方法。     

鸡毒支原体弱毒F株与强毒株二重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

研究根据基因库中鸡毒支原体(MG)S6毒株和F株的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的二重荧光定量PCR检测方法,与其它禽类呼吸道病原体无交叉反应,对MG模板的灵敏度检测限为10拷贝/μL,对MG强弱毒模板以不同的浓度进行组合,仍可有效地检测到毒株,批内和批间重复变异系数小,特异性强、灵敏度高、稳定性好。研究建立的二重荧光定量PCR方法可用于MG强、弱毒株的鉴别检测,为该病的防控与净化提供良好工具。     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法的建立(英文)

[目的]建立贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法。[方法]根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比。[结果]所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。[结论]研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。     

H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速、特异、敏感的H6亚型禽流感病毒(AIV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。针对H6亚型AIV的血凝素(HA)基因序列保守区设计1对引物,并优化反应条件。结果表明,该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出1 000倍;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(80.81±0.08)℃,组内变异系数为0.08%～0.99%,组间变异系数为1.85%,可重复性好;对H1、H3、H5、H7、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒等其他呼吸道病原体无扩增;检测快速,从样本处理到报告结果仅需3.5 h。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒2型二重实时荧光定量PCR检测方法的建立

以胸膜肺炎放线杆菌(App)apx ⅣA基因和猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因为靶基因,分别设计特异性引物和探针,建立App和PCV-2的二重荧光PCR方法。App引物扩增的目的片段大小为132bp,PCV-2为169bp。建立的方法可在同一反应体系中同时对App和PCV-2进行定量检测鉴别,其敏感性分别为1×101拷贝和1×100拷贝,对其他猪病病原核酸的检测为阴性。利用该方法对10份人工感染临床样品进行检测试验,其结果符合率达100%,说明该方法可用于对临床样品中App和PCV-2的检测。