非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。     

非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法的建立

建立一种具有高灵敏度的检测非洲猪瘟病毒的微滴数字PCR方法,为非洲猪瘟的快速诊断和流行病学研究提供技术支持。在《OIE陆生动物诊断与疫苗手册》中提供的qPCR检测方法的基础上,建立了非洲猪瘟病毒微滴数字PCR方法,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法的最低检测限可达0.8copies/μL,敏感性高于qPCR方法,不与猪常见的6种病毒发生交叉反应,而且重复性较好。采用建立的微滴数字PCR和OIE的qPCR方法分别对78份临床病料进行非洲猪瘟病毒的检测,结果显示2种方法的符合率为100%。本研究建立的微滴数字PCR方法具有理想的敏感性和特异性,适用于临床上非洲猪瘟病毒的检测。     

水貂犬瘟热病毒微滴数字PCR检测方法的建立与应用

为建立检测水貂犬瘟热病毒(mink canine distemper virus, CDV)的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量方法，以便提供水貂CDV在诊断检测方面的技术支持，本研究根据实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法原理，建立了水貂CDV数字PCR方法，并优化了反应条件，评估了特异性、敏感性以及重复性。结果表明：ddPCR方法检测CDV的最适引物浓度为900 nmol/L,探针浓度为250 nmol/L,退火温度为55℃,升降温度为2.5℃/s,最低检测下限为4.4拷贝/μL;除CDV特异性扩增，其他常见病毒特异性检测结果均为阴性；重复性试验的变异系数均小于5%。采用该微滴数字PCR和荧光定量RT-PCR方法对30份犬、貂、狐、貉等组织(其中CDV阳性样品7份)样品进行检测，检测结果与临床检测结果相符。本研究建立的微滴数字PCR方法对CDV定量检测特异性强、灵敏度高，重复性好，可以用于水貂CDV临床样品的核酸检测，对水貂CDV发病早期的诊断提供新的定量检测方法。     

狂犬病病毒微滴式数字PCR检测方法的建立

为了建立可绝对定量狂犬病病毒(RABV)的微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本试验根据RABV基因组起始区域设计引物和探针,继而优化引物和探针浓度以及退火温度,并对建立的ddPCR方法的灵敏度、特异性和重复性进行分析。结果显示：ddPCR方法的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃;ddPCR方法的标准曲线相关系数(R²)为0.999,呈现良好的线性关系;灵敏度高,最低可检测到3.37 copies/μL;特异性良好,与常见犬病原无交叉反应;重复性好,检测结果稳定。临床样品的检测结果显示,本试验建立的狂犬病病毒ddPCR方法与实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)方法的符合率为100%。结果表明,本试验建立的狂犬病病毒微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于狂犬病病毒的绝对定量检测。     

鸡细小病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可定量检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus, ChPV)的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)新型检测方法。引物设计参考了GenBank中ChPV的NS基因保守序列，筛选了特异性探针引物组，采用不同探针引物浓度组合和退火温度梯度对反应条件进行优化，并通过使用该方法与荧光定量PCR(qPCR)和普通PCR方法进行灵敏度比较，同时对其他常见禽病病原体进行检测，以及对40份临床样品进行检测，评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示，该方法最佳引物浓度均为900 nmol/L,最佳探针浓度为600 nmol/L;最佳退火温度为54.0℃;灵敏度比qPCR和普通PCR分别高10倍和1000倍，最低检测限为4.5 copies/μL;对其他常见禽病病原体进行ChPV微滴式数字PCR检测，结果均为阴性；批内和批间重复性较好，变异系数小。结果表明，所建立的ddPCR方法具有更高的敏感性和准确性，可成功用于快速定量检测ChPV感染。     

鸭坦布苏病毒微滴式数字RT-PCR定量检测方法的建立与初步应用

为建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的鸭坦布苏病毒(DTMUV)数字RT-PCR定量检测方法,采用鸭坦布苏病毒E基因为靶基因,在前期实时荧光定量RT-PCR方法的基础上,建立了可对其准确定量的微滴式数字RT-PCR方法。通过对反应体系中引物、探针浓度以及反应条件中反转录温度、时间、退火温度进行优化,确定最佳引物浓度为700 nmol/L,最佳探针浓度为350 nmol/L。该方法线性关系良好,在模板浓度为10~0～10~4拷贝/μL范围内其有良好的线性关系(R~2=0.993 4);最低检测限为6.4拷贝/反应,比相同引物探针建立的实时荧光定量RT-PCR方法敏感一个数量级;同时,与其他禽源病毒无交叉反应,且重复性良好,对于10~3数量级的模板进行重复性检测,变异系数仅1.22%。通过对临床样品进行检测,结果显示该方法与实时荧光定量RT-PCR结果一致,表明该微滴式数字RT-PCR方法特异性强、敏感性高,可用于鸭坦布苏病毒的定量检测。     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株微滴数字PCR鉴别方法的建立

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本研究建立的dd PCR方法能够特异性地鉴别检测PRV野毒株和疫苗株,与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应;该方法针对PRV gD、gE基因的检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL,分别比相应的荧光定量PCR (qPCR)方法敏感性高10倍和5倍;针对PRV gD、gE基因的批内和批间重复性试验结果变异系数(C.V)均小于4%;通过对45份临床样品的检测,结果显示,与病毒分离方法相比,dd PCR方法敏感性为91.7%,特异性为97.2%,符合率为97.8%;与dd PCR方法相比,q PCR的敏感性为83.3%,特异性为94.3%,符合率为95.6%。本研究建立的dd PCR方法在检测低拷贝临床样品时敏感性更高、特异性强、重复性好,可以作为PRV野毒株与疫苗株的鉴别、准确定量的有效检测手段。     

1种布鲁氏菌微滴式数字PCR检测方法的建立

本研究旨在构建1种布鲁氏菌（Brucella）微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR，ddPCR）。以布鲁氏菌BCSP31基因为靶基因，选取保守区域设计引物和探针，构建了布鲁氏菌微滴式数字PCR方法。然后优化了ddPCR反应中的引物、探针浓度及退火温度，并进行方法的灵敏度、特异性和重复性试验。结果表明，ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol·L^-1和250 nmol·L^-1，最佳的退火温度为58℃。ddPCR的线性良好，最低检测下限为1.12 copies·μL^-1，与大肠杆菌O：157菌株等其他4种细菌无交叉反应，而且批内重复性和批间重复性都较好。综上表明，本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强，可对布鲁氏菌感染的临床样品进行定量检测。     

布氏杆菌微滴数字PCR方法的建立

为建立一种布氏杆菌微滴数字PCR qPCR方法,对布氏杆菌病的定量诊断提供技术支持,在实时荧光PCR (qPCR)检测方法(T/CVMA 20-2020)的基础上,建立了布氏杆菌微滴数字PCR方法,并对方法的反应条件进行了优化,同时对其敏感性、特异性、重复性进行了评估.结果 显示:本方法的最低检测下限为2.6 copi...     

针对猪瘟病毒E2蛋白的实时荧光定量PCR方法的建立及应用

根据猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的保守序列,设计合成一套特异性引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化后,检测其特异性和灵敏性。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR在101～108范围内线性相关系数为0.997,能够检测到相当于10 copies/μL的病毒核酸,比常规PCR检测方法敏感性强;采用建立的实时荧光定量PCR方法检验猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果,特异性强;变异系数为0.09%～0.7%,小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的猪瘟病毒实时荧光定量PCR方法为临床上猪瘟病毒的诊断和定量研究提供了重要的检测工具。     

Establishment and Application of Real-time Quantitative PCR Assay for Detection of Classical Swine Fever Virus

A Real-time quantitative PCR assay for detection of classical swine fever virus (CSFV) was developed using the specific probe and primers designed basing on the E2 gene of CSFV. The Real-time quantitative PCR assay was established using the total RNA of CSFV as template. The specificity, sensitivity and repeatability of the assay were tested, and samples taken from clinic suspicious CSFV infected pigs had been testified by the established assay. The results indicated that the Real-time quantitative PCR assay was successfully established, and showed a good linear relationship at a template range of 10¹ to 10⁶ copies/μL with a coefficient correlation of 0.999; The specificity of the assay revealed that amplifications were showed on CSFV samples, but other pathogens had no amplifications; The sensitivity of the assay was 10 copies/μL nucleic acid and 1 TCID₅₀/mL virus; Meanwhile,19 positive samples were detected, which were consistent with results of CSFV detected by Nested RT-PCR, cloning and sequencing. The eatablished Real-time quantitative PCR assay was specific, sensitive rapid and suitable for early detection and epidemiological study of CSFV.     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感、特异的猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中CSFV E2基因保守区域序列,设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以CSFV总RNA为反转录模板,经优化反应条件,建立CSFV实时荧光定量PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了检测。结果表明,本研究建立的CSFV实时荧光定量PCR检测方法在10¹~10⁶拷贝/μL范围内有很好的线性关系,相关系数为0.999;CSFV细胞培养物出现阳性扩增信号,但ST正常细胞对照和其他8种病原对照未出现扩增,特异性良好;该方法重复性好、敏感性高,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,并且CSFV的最低检测限为1 TCID₅₀/mL;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,与本课题组建立的CSFV Nested RT-PCR检测结果和克隆测序结果一致。本研究成功建立了CSFV实时荧光定量PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测。     

猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R²=0.999;敏感性高,最低检测限为1×10¹拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%。人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础。     

鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在10⁰~10⁶拷贝·μL^-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL^-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。     

1种检测新城疫病毒的微滴式数字PCR方法

本研究旨在构建一种新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR，ddPCR）。以NDV F基因为靶基因，选取保守区域设计引物和探针，构建了NDV ddPCR。对ddPCR反应引物和探针浓度、退火温度进行了优化，并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行测定。试验结果表明，ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900和250 nmol·L^-1，最佳的退火温度为55℃。ddPCR的线性良好，最低检测下限为1.8 copies·μL^-1，与禽传染性支气管炎病毒等其他6种病毒无交叉反应，样本重复的变异系数为2.4%。结果提示，本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强，可对新城疫病毒感染的临床样品进行定量检测。     

A Droplet Digital PCR Method for Detection of Newcastle Disease Virus

This experiment was conducted to establish a droplet digital PCR (ddPCR) method for the detection of Newcastle disease virus (NDV). A ddPCR method was developed, which the primers and probes were designed based on the conservative regions of F gene of NDV. The concentration of primer and probe, the annealing temperature in ddPCR reaction were optimized. The sensitivity, specificity and reproducibility of ddPCR method were evaluated. In results, the optimal primer concentration and the probe concentration were 900 and 250 nmol·L^-1, the optimum annealing temperature was 55℃. The detection limit of ddPCR method was 1.8 copies·μL^-1 with a good linear response, it had no cross reaction with other six viruses (include IBV), the coefficient of variation of sample repetition was 2.4%. All the results showed that NDV ddPCR was sensitive and specific, it was suitable for quantitative detection of clinical samples infected with NDV.     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。