猫冠状病毒S蛋白原核表达及鉴定

猫传染性腹膜炎是由猫冠状病毒(Feline coronavirus,FCoV)引起的慢性致死性疾病,以腹膜炎、大量腹水积聚为主要特征,不同年龄的猫均可感染,但老龄猫和2岁以内的猫发病率较高,纯种猫发病率高于一般品种的家猫,传染率非常高。本研究将猫冠状病毒S基因进行碱基序列优化并合成,亚克隆至PET30a,得到原核表达载体PET30a-NTU-2-S-RBD,进行大量诱导表达并纯化,最终得到的蛋白纯度可达90%,为后续疫苗的制备及诊断方法的建立奠定基础。     

猪δ冠状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为灵敏、快速检测猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）,根据PDCoV M基因保守区域设计引物和探针,建立了一种PDCoV实时荧光RT-PCR检测方法,并评价了该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,该方法的拷贝数对数值与Ct值在1.3×103~1.3×107 copies/μL拷贝数浓度范围内呈现良好的线性关系,R2 = 0.994;最低检出限为13 copies/μL,且无非特异性扩增;批内和批间重复性试验变异系数（CV）为0.24%~2.15%,均小于3%。利用该方法和普通RT-PCR对42份临床样品同时进行检测,发现本方法比普通RT-PCR灵敏性更高,二者符合率为95.2%。以上结果表明,本试验建立的实时荧光RT-PCR方法灵敏、特异、可靠,可用于PDCoV的临床检测和流行病学调查。     

绵羊感染伪狂犬病的病理学观察与病毒分离鉴定

为了确诊1例疑似绵羊伪狂犬病病例,本试验以上海郊区某羊场发病绵羊的病料为研究对象进行了病理学观察、病毒分离和鉴定。病理组织学变化显示,发病羊大脑组织神经元发生广泛性变性、坏死并伴有嗜神经现象,神经元周围出现胶质细胞增生。病料接种BHK-21细胞,细胞出现病变,间接免疫荧光试验和荧光定量PCR检测结果证实所分离的病毒为伪狂犬病病毒。流行病学调查结果表明,绵羊伪狂犬病可能是由猪伪狂犬病病毒感染引起的。通过免疫接种猪伪狂犬病弱毒疫苗,绵羊伪狂犬病疫情得到及时控制。     

用四重PCR检测方法检测产单核细胞李斯特菌

为了同时快速准确的检测产单核细胞李斯特菌以及是否为有毒力的产单核细胞李斯特菌,根据相关文献报道的四重PCR方法,针对该菌的种特异性基因inl A基因进行引物设计,扩增片段大小为800bp,结果应用该PCR法可特异性的扩增出目的基因片段,与GenBank上发表的序列同源性为97.3%。同时通过对毒力基因inlB,inlC和inlJ的检测用来判断菌株的相关毒力。而同一属的其他菌种无害李斯特菌(L.innocua),韦氏李斯特菌(L.welshimeri)均无特异条带,嗜水气单胞菌(J-1),产气荚膜梭菌(C57-13),大肠埃希菌(ATCC 25922),鼠伤寒沙门菌(C79-32),金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)结果均为阴性。对临床上送检的23份样品进行四重PCR方法检测并同时与国家标准GB/T22429-2008食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验中使用的检测方法进行比对,两种检测方法的结果完全符合,均检测出7份阳性样品。并且四重PCR法表明这7份阳性样品中的产单核细胞李斯特菌均携带有3种毒力因子(inlB,inlC和inlJ),因此该四重PCR法可用于快速鉴定是否是有毒力的产单核细胞李斯特菌,为有效预防控制产单核细胞李斯特菌污染提供技术支撑。     

上海地区多种动物莱姆病的血清学调查

为探讨猪、牛、羊、马、犬、鸡、鸭和野鸟等与人类关系密切的多种动物莱姆病的血清流行病学状况,从上海地区采集血清870份,应用酶联荧光测定技术(ELFA)检测莱姆病抗体。猪、牛、羊、鸡、鸭和野鸟中均未检测到莱姆病抗体,马血清中莱姆病抗体阳性率为18.5%,犬血清中莱姆病抗体阳性率为12.3%。结果表明,上海地区动物群中莱姆病的感染率相对较低,马和犬在莱姆病传播中的重要性应引起重视。     

Fusion Expression and Purification of Marek’s disease virus Tegument Protein VP16 and Its Antibody Preparation

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus ,MDV)UL48基因编码的蛋白与单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus ,HSV)衣壳蛋白VP16为同源物，将其克隆入pET-32a载体中，获得pET-VP16, 转化Escherichia coli BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳显示:融合蛋白获得可溶性表达，表达蛋白的相对分子量约为67 kD；将表达的融合蛋白过His·Bind柱，获得纯化的蛋白，将该蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过间接ELISA和Western blot鉴定制备的多克隆抗体的效价和特异性，结果表明，该抗体具有较高的特异性，间接ELISA效价大于2×10－5。     

马立克氏病病毒CVI988株病毒囊膜糖蛋白B启动子的克隆及活性分析

为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病毒对载体的重组病毒的免疫保护力,克隆了马立克氏病病毒(MDV)CVI988株病毒囊膜糖蛋白B(gB)启动子,通过测序分析发现克隆的gB启动子与GenBank上发表的MDVGA株序列的同源性为99.5%。分别以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和虫荧光素酶(luciferase)为报告基因,构建pSK-gB-LacZ和pgB-Luc真核表达载体。将pSK-gB-LacZ转染的中国地鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞进行染色,出现蓝色,说明在CHO细胞中,MDVgB启动子可以有效地调控lacZ基因的转录。在CEF细胞中,利用虫荧光素酶系统将gB启动子与SV40及hCMV启动子进行活性比较,发现hCMV启动子的活性为gB启动子的31倍,SV40启动子为gB启动子的27倍。     

1株猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列的遗传演化分析

为了解猫杯状病毒形态特征及遗传演化情况,采用F81细胞从患病宠物猫的鼻拭子样品中分离获得1株猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV),命名为SH1。经电镜观察,病毒粒子呈球形,无囊膜,符合FCV的形态特征。采用RT-PCR方法扩增了该毒株的全基因组,并进行了序列测定和衣壳蛋白基因(ORF2)序列的分析。结果显示:分离株与国内外参考株的ORF2序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为74.1%~79.7%和84.5%~90.9%;ORF2基因的遗传演化分析显示,30株FCV毒株形成两大分支,即基因群Ⅰ和Ⅱ,分离株属于基因群Ⅰ;进一步分析发现,基因群Ⅰ和Ⅱ主要在377、539和557氨基酸位点存在差异,基因群Ⅰ和Ⅱ分别为N、A、G和K、V、S。研究结果为FCV感染的防控提供科学依据。     

副溶血性弧菌PCR检测方法的建立

为了建立适于基层单位应用的针对副溶血性弧菌检测的特异PCR方法,检测副溶血性弧菌的基因序列.针对该菌的属特异性基因t1基因进行引物设计,扩增片段大小为449 bp.运用该PCR法可特异性的从副溶血性弧菌ATCC17802标准株中扩增出目的基因片段,与GenBank上发表的序列同源性为100%.而经常污染海产品的溶藻弧菌,嗜水气单胞茵标准株J-1,铜绿假单胞茵标准株ATCC27853结果均为阴性.该PCR法最低检出菌体DNA量为10-2ng以及最低检出菌数为5.7 × 103 CFU/mL.对临床上送检的35份样品进行菌体DNA PCR方法检测并同时与国标GB/T4789.7-2003中使用的检测方法进行比对,两种检测方法的结果完全符合,与国标中使用的检测方法相比可大大缩短鉴定时间.因此该PCR法能快速鉴定当前副溶血性弧菌流行群,有利于流行病学溯源等研究.     

上海市定点监测猪群伪狂犬病病原学调查与病毒分离鉴定

为了解上海市定点监测猪群伪狂犬病病毒(PRV)感染情况,对2014—2015年来自兽医疾病诊断中心、种猪场、屠宰场和规模场的1 863份样品进行PRV荧光定量PCR检测。结果显示,共检出48份PRV核酸阳性,总阳性率为2.6%(48/1 863),其中2014年为4.3%(39/898),2015年为0.9%(9/965),呈现大幅下降趋势,表明上海市通过加强PR免疫,淘汰散养和中小型养殖场,加强种猪场PR净化等措施,使本市猪群的PRV感染得到了有效控制。对部分阳性样品用BHK-21细胞进行PRV分离鉴定,共获得12株病毒,并对其中1株毒株进行了病毒毒价测定,获得了稳定的毒价,这为下一步的动物试验奠定了良好基础。