猫冠状病毒S蛋白原核表达及鉴定

猫传染性腹膜炎是由猫冠状病毒(Feline coronavirus,FCoV)引起的慢性致死性疾病,以腹膜炎、大量腹水积聚为主要特征,不同年龄的猫均可感染,但老龄猫和2岁以内的猫发病率较高,纯种猫发病率高于一般品种的家猫,传染率非常高。本研究将猫冠状病毒S基因进行碱基序列优化并合成,亚克隆至PET30a,得到原核表达载体PET30a-NTU-2-S-RBD,进行大量诱导表达并纯化,最终得到的蛋白纯度可达90%,为后续疫苗的制备及诊断方法的建立奠定基础。     

Fusion Expression and Purification of Marek’s disease virus Tegument Protein VP16 and Its Antibody Preparation

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus ,MDV)UL48基因编码的蛋白与单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus ,HSV)衣壳蛋白VP16为同源物，将其克隆入pET-32a载体中，获得pET-VP16, 转化Escherichia coli BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳显示:融合蛋白获得可溶性表达，表达蛋白的相对分子量约为67 kD；将表达的融合蛋白过His·Bind柱，获得纯化的蛋白，将该蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过间接ELISA和Western blot鉴定制备的多克隆抗体的效价和特异性，结果表明，该抗体具有较高的特异性，间接ELISA效价大于2×10－5。     

马立克氏病病毒CVI988株病毒囊膜糖蛋白B启动子的克隆及活性分析

为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病毒对载体的重组病毒的免疫保护力,克隆了马立克氏病病毒(MDV)CVI988株病毒囊膜糖蛋白B(gB)启动子,通过测序分析发现克隆的gB启动子与GenBank上发表的MDVGA株序列的同源性为99.5%。分别以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和虫荧光素酶(luciferase)为报告基因,构建pSK-gB-LacZ和pgB-Luc真核表达载体。将pSK-gB-LacZ转染的中国地鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞进行染色,出现蓝色,说明在CHO细胞中,MDVgB启动子可以有效地调控lacZ基因的转录。在CEF细胞中,利用虫荧光素酶系统将gB启动子与SV40及hCMV启动子进行活性比较,发现hCMV启动子的活性为gB启动子的31倍,SV40启动子为gB启动子的27倍。     

猪δ冠状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为灵敏、快速检测猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）,根据PDCoV M基因保守区域设计引物和探针,建立了一种PDCoV实时荧光RT-PCR检测方法,并评价了该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,该方法的拷贝数对数值与Ct值在1.3×103~1.3×107 copies/μL拷贝数浓度范围内呈现良好的线性关系,R2 = 0.994;最低检出限为13 copies/μL,且无非特异性扩增;批内和批间重复性试验变异系数（CV）为0.24%~2.15%,均小于3%。利用该方法和普通RT-PCR对42份临床样品同时进行检测,发现本方法比普通RT-PCR灵敏性更高,二者符合率为95.2%。以上结果表明,本试验建立的实时荧光RT-PCR方法灵敏、特异、可靠,可用于PDCoV的临床检测和流行病学调查。     

含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体的构建及初步应用

【目的】为了构建MDV1细菌人工染色体，以便快速有效地进行重组病毒的筛选，进行了含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体的构建。【方法】利用DNA重组技术，构建了含有E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体，利用脂质体，将线性化的转移载体转染入已感染CVI988病毒的CEF，用MX-HAT药物筛选3代以后，用X-gal染色,挑取阳性克隆。【结果】经测序分析发现，人工体外合成的单一loxP位点，序列正确，另外，同源重组左臂和右臂序列正确，并且相对连接。利用SphⅠ和NheⅠ双酶切，鉴定出含有同向LoxP位点的转移载体，将其命名为pUS-BGS。将该载体用NheⅠ线性化后，用脂质体转染已感染CVI988病毒的CEF，用MX-HAT药物筛选3代以后，X-gal染色，可以观察到呈现蓝色的重组病毒。【结论】本研究报道了含有E.coli F因子以及两同向的loxP位点的MDV1转移载体的构建，利用该载体可以有效地进行重组病毒的筛选，为下一步MDV1细菌人工染色体的构建奠定了基础。     

含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDVI）转移载体的构建及初步应用

【目的】为了构建MDVI细菌人工染色体，以便快速有效地进行重组病毒的筛选，进行了含EcoliF因子的马立克氏病病毒I型（MDVI）转移载体的构建。【方法】利用DNA重组技术，构建了含有EcoliF因子的马立克氏病病毒I型（MDVI）转移载体，利用脂质体，将线性化的转移载体转染入已感染CVI988病毒的CEF，用Mx—HAT药物筛选3代以后，用x—gal染色，挑取阳性克隆。【结果】经测序分析发现，人工体外合成的单一loxP位点，序列正确，另外，同源重组左臂和右臂序列正确，并且相对连接。利用SphI和NheI双酶切，鉴定出含有同向LoxP位点的转移载体，将其命名为pUS—BGS。将该载体用NheI线性化后，用脂质体转染已感染cVI988病毒的CEF，用MX—HAT药物筛选3代以后，x—gaI染色，可以观察到呈现蓝色的重组病毒。【结论】本研究报道了含有Ecol／F因子以及两同向的loxP位点的MDVI转移载体的构建，利用该载体可以有效地进行重组病毒的筛选，为下一步MDVI细菌人工染色体的构建奠定了基础。     

实验室检测畜禽主要病毒性疾病样品的采集、运输及选择

<正>混合感染已经成为当前畜禽传染性疾病流行的最主要特征之一,导致发病率和死亡率的显著上升,带来巨大的经济损失,同时也造成了临床症状的不典型,给诊断带来了极大的难度。临床上,我们很难简单地将几个症状组合起来就能判定是什么疾病。而正确判断畜禽疫病需根据流行情况、临床症状、剖检和实验室病原检测来确诊。病原检测是确诊的主要依据,而要做好实验室检测,采、送样品是关键。规范的采集、保存和运送样品,是实现     

1株猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列的遗传演化分析

为了解猫杯状病毒形态特征及遗传演化情况,采用F81细胞从患病宠物猫的鼻拭子样品中分离获得1株猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV),命名为SH1。经电镜观察,病毒粒子呈球形,无囊膜,符合FCV的形态特征。采用RT-PCR方法扩增了该毒株的全基因组,并进行了序列测定和衣壳蛋白基因(ORF2)序列的分析。结果显示:分离株与国内外参考株的ORF2序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为74.1%~79.7%和84.5%~90.9%;ORF2基因的遗传演化分析显示,30株FCV毒株形成两大分支,即基因群Ⅰ和Ⅱ,分离株属于基因群Ⅰ;进一步分析发现,基因群Ⅰ和Ⅱ主要在377、539和557氨基酸位点存在差异,基因群Ⅰ和Ⅱ分别为N、A、G和K、V、S。研究结果为FCV感染的防控提供科学依据。     

副溶血性弧菌PCR检测方法的建立

为了建立适于基层单位应用的针对副溶血性弧菌检测的特异PCR方法,检测副溶血性弧菌的基因序列.针对该菌的属特异性基因t1基因进行引物设计,扩增片段大小为449 bp.运用该PCR法可特异性的从副溶血性弧菌ATCC17802标准株中扩增出目的基因片段,与GenBank上发表的序列同源性为100%.而经常污染海产品的溶藻弧菌,嗜水气单胞茵标准株J-1,铜绿假单胞茵标准株ATCC27853结果均为阴性.该PCR法最低检出菌体DNA量为10-2ng以及最低检出菌数为5.7 × 103 CFU/mL.对临床上送检的35份样品进行菌体DNA PCR方法检测并同时与国标GB/T4789.7-2003中使用的检测方法进行比对,两种检测方法的结果完全符合,与国标中使用的检测方法相比可大大缩短鉴定时间.因此该PCR法能快速鉴定当前副溶血性弧菌流行群,有利于流行病学溯源等研究.     

上海市某马场马疱疹病毒1型感染的确诊

采用马疱疹病毒1型和4型二重PCR分型方法,对上海市某马场临床疑似病例的鼻拭子和血浆样品进行检测,同时对扩增产物进行测序和比对,确诊为马疱疹病毒1型阳性,表明上海市马群中存在马疱疹病毒1型感染。因此,应提高上海市马匹饲养管理水平,加强马疱疹病毒1型的定期免疫和检疫,及时对阳性马匹进行隔离,对马厩进行消毒。