猪圆环病毒2型RPA恒温扩增检测方法的建立及初步应用

利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),以猪圆环病毒2型Cap基因的保守序列为靶序列设计并筛选出一组特异性的引物和探针,建立了快速检测猪圆环病毒2型核酸的RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)核酸检测结果均为阴性,灵敏性高,最低可检出核酸浓度为0. 87×10-4ng/μL,简单快速,且重复性好。利用所建立的RPA方法对183份临床样品进行检测,结果与实时荧光PCR方法符合率为98. 9%。本研究为猪圆环病毒2型核酸的快速检测提供了一种新方法,尤其适合基层实验室或养猪场的快速检测。     

蓝舌病16型病毒核心样颗粒的获取与鉴定

为了制备一种新型基因工程疫苗BTV-16 VLP疫苗,将蓝舌病病毒16型VP3与VP7基因片段插入杆状病毒双表达载体pFastBac Dual质粒中,通过转染Sf9细胞,同时表达VP3与VP7蛋白。经负染后电镜观察到有与蓝舌病病毒形态相似的核心样颗粒,表明蓝舌病VP3与VP7蛋白能自主组装形成核心样颗粒,并通过Western Blot试验验证该核心样颗粒与蓝舌病病毒具有相同的抗原性。因此本研究成功构建出16型蓝舌病病毒核心样颗粒,为病毒样颗粒装配打下了基础,为制备16血清型BTV VLP疫苗做好前期准备。     

自贸区动植检快筛实验室建设要素分析

基于前海蛇口自贸区动植物检疫工作的现状和需求,对自贸区动植检快筛实验室的建设要素进行了分析和探讨,提出了以快筛快检、生物安全监测和技术交流平台为主要功能,建立自贸区动植检快筛实验室,并在实验室的建立标准、质量控制和生物安全等方面提出了初步建议,以期为自贸区动植检快筛实验室的建设提供借鉴。     

小反刍兽疫病毒特异性IgY抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本研究制备了针对小反刍兽疫PPRV全病毒特异性卵黄抗体,利用PPRV N蛋白特异性单克隆抗体和PPRV IgY为主要材料,建立了PPRV双夹心ELISA检测方法检测小反刍兽疫病毒。用该ELISA方法分别检测小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水泡性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒,结果表明该ELISA方法可以特异性检出PPRV而与其他病毒间无交叉。用该ELISA和RT-PCR同时检测162份临床样品,结果表明ELISA的特异性和敏感性分别为99.2%和93.7%,两种方法的符合率为98.1%。该方法的建立为小反刍兽疫病毒的初筛检测及小反刍兽疫流行病学调查提供了经济、快速、有效的方法,适用于设备条件不足的基层实验室。     

小反刍兽疫病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法的建立

为建立小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)可视化快速检测方法,本研究根据PPRV N基因的保守序列设计、合成和筛选出反转录重组聚合酶介导恒温扩增(RT-RAA)特异性引物和CRISPR/Cas12a特异性crRNA。结合侧向流试纸,本研究建立了一种PPRV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法,并对该方法的性能进行了评估。结果显示,该方法特异性良好,与蓝舌病毒(BTV)、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、羊痘病毒(CaPV)、猪水泡病病毒(SVDV)、伪狂犬病毒(PRV)等病毒核酸无交叉反应;敏感性高,最低可检出4.30×10¹拷贝/μL的PPRV核酸;应用该方法及国家标准推荐的RT-qPCR方法对60个模拟样品进行平行检测,结果显示Kappa值为0.918,表明两者具有高度一致性。综上表明,本研究建立的PPRV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法特异性好、敏感性高,且操作简单、无需特殊仪器,可应用于野外或基层农场的PPRV快速筛查检测工作...     

检测非洲猪瘟病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法的建立

利用非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白不同抗原表位的2株单克隆抗体,1株作为捕获抗体,另1株用辣根过氧化物酶(HRP)标记后作为检测抗体,采用方阵法对ELISA反应条件进行优化,建立了检测ASFV抗原的双抗体夹心ELISA方法。结果显示,该方法中捕获抗体包被质量浓度为1.25 mg/L,酶标单克隆抗体的最适稀释度为1∶4 000。通过试验确定该方法的临界值为0.299,当样品D₄₅₀值≥0.3,且P/N大于2时,判定为阳性。该双单抗夹心ELISA方法可特异性检测ASFV抗原,其他抗原检测结果均为阴性,特异性强;重复性好,批内和批间变异系数(CV)均小于8%。应用本研究建立的方法与荧光PCR方法同时对225份临床样品进行检测,总符合率为96.89%。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可用于ASFV抗原的大量样品检测,为ASF防控提供了技术支持。     

鸡传染性贫血病毒VP2基因在真核细胞中的表达以及对宿主细胞增殖的影响

鸡传染性贫血是危害养禽业的重要疫病之一,其病原体是鸡传染性贫血病毒(CIAV)。该病原广泛存在于世界各地,是危害养禽业的主要病原。VP2是该病毒的重要非结构蛋白,其对宿主细胞的确切作用还不十分清楚。本文通过PCR从病毒DNA中扩增出VP2基因并将VP2基因亚克隆到真核表达载体pcDNA4.0。将重组质粒转染至BHK细胞,经Western-blotting证实,转染的真核细胞能表达VP2蛋白并具有良好的抗原性。pcDNA4.0-VP2转染293T或BHK细胞后,与对照组(空载体转染细胞以及未转染的细胞)相比,VP2超表达对这两种细胞的增殖没有影响。该结果表明鸡传染性贫血病毒的VP2基因不影响宿主细胞的增殖。     

非洲马瘟病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲马瘟病毒（AHSV）S7基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了检测AHSV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）方法。该方法特异性强,仅AHSV检测为阳性,蓝舌病病毒（BTV）、马流感病毒（EIV）、马动脉炎病毒（EAV）等病原检测均为阴性;灵敏性高,最低检出限为2.36×101 copies/μL;反应快速,检测时间为20 min,同时具有良好的重复性。利用该方法和实时荧光RT-PCR平行检测60份临床样品,符合率为100%。结果表明,本研究建立的AHSV RT-RPA检测方法特异、敏感、快速且结果可靠,适用于AHSV的高通量、快速检测。     

BTV-16四结构蛋白的共表达与病毒样颗粒的制备

目前疫苗免疫是预防蓝舌病的主要有效手段,蓝舌病病毒样颗粒(VLPs)疫苗是蓝舌病疫苗研究的热点之一。为了制备蓝舌病病毒血清16型(BTV-16)病毒样颗粒,研究对载体pFastBac-Dual进行了改造,使其具有4个独立启动子的多克隆位点。依次将BTV-16 VP2、VP5、VP3和VP7基因插入到改造后载体(pF4)的4个多克隆位点中,成功构建了四表达重组质粒pF4-VP2-VP5-VP3-VP7,经转座获得重组杆粒Bacmid-VP2-VP5-VP3-VP7。通过转染Sf9细胞,获得可表达4种蛋白的重组杆状病毒rBac-VP2-VP5-VP3-VP7。经重组杆状病毒感染Sf9细胞,可共表达蛋白VP2、VP5、VP3和VP7,并通过蔗糖梯度离心制备出具有典型特征的BTV-16病毒样颗粒。