口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株基因组全长感染性克隆的构建

利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3'端覆盖口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBlueseriptSK+载体上.利用融合PCR扩增到基因组5'端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp),并将其连接至pGEM-T载体.最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo(+)中构建该病毒株的全长cDNA克隆.以构建的FMDV Asial/JS/China/2005株全长cDNA为模板,使用TTRNA聚合酶在体外转录得到病毒RNA,通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒.对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒.该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础.     

鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法对其基因组分10个片段进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中进行测序。经BsaⅠ限制性内切酶酶切后,采用优化的连接策略将各DNA片段进行连接,获取H120株的基因组全长cDNA,其5′端具有完整的T7RNA聚合酶启动子的核心序列,3′端具有polyA尾巴结构。通过T7RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,转染BHK-21细胞并进行病毒拯救。采用RT-PCR、测序及鸡胚传代对拯救出的病毒株进行鉴定。结果表明成功地从H120株的基因组全长cDNA拯救出病毒H120-R株,为进一步开展该病毒的分子致病机理研究、新型疫苗的研制等奠定了基础。     

猪瘟病毒低温诱变疫苗Thiverval株感染性克隆的构建及病毒拯救

采用高保真DNA聚合酶,分7个片段扩增猪瘟病毒(CSFV)Thiverval株全基因组序列,克隆至pMD18-T载体并测序.经适当的连接策略将各片段连接克隆至低拷贝载体质粒pAC/F101,同时对病毒基因组5'和3'末端进行修饰,构建出含有T7启动子、榔头状(HH)核酶基因、CSFV Thiverval全基因组、丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和T7终止子的重组质粒pAC/F101/T1-7.利用T7 RNA聚合酶将线性化重组质粒pAC/F101/T1-7体外转录成基因组RNA,再使用脂质体转染将体外转录RNA转染PK-15细胞.通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,表明成功的从感染性克隆拯救出活病毒粒子.猪瘟病毒低温诱变疫苗"Thiverval"株感染性克隆的构建及病毒的成功拯救,为进一步研究CSFV疫苗株的致弱机制提供了重要工具.     

口蹄疫病毒O型OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建

为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)的感染性克隆,采用RT-PCR将O型FMDV OHM/02株全长基因组分为5个重叠的片段进行扩增,克隆至载体pUC57中,获得全长cDNA克隆pPO-1。将线性化的pPO-1与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,出现致细胞病变效应(CPE)。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切、测序,表明人工设计的分子标记Bam HⅠ酶切位点消失,排除了亲本毒株污染的可能性。间接免疫荧光试验可以检测到绿色荧光,电镜观察可观察到病毒粒子,表明构建了具有感染性的OHM/02毒株全长cDNA克隆。病毒生长曲线表明,拯救病毒与亲本病毒的复制能力和增殖特性相似。OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建及拯救可为FMDV致病机理的研究提供一种重要工具,可促进疫苗的研发。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒XH株感染性克隆的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统,本实验采用RT-PCR方法将PRRSV-XH株的基因组序列分为6个片段进行扩增,连接至低拷贝载体pOKQ中,获得全长cDNA克隆。将该克隆体外转录,经脂质体转染Marc-145细胞,观察细胞病变。经RT-PCR、间接免疫荧光和western blot等试验验证,表明构建了具有感染性的PRRSV-XH株全长cDNA克隆。本实验为在分子水平上研究PRRSV的复制、致病机理和基因产物的功能等方面提供技术支持,并为构建新型病毒载体和开发安全有效的活病毒疫苗奠定基础。     

口蹄疫病毒WFL株基因组全长cDNA的克隆及序列分析

根据口蹄疫病毒基因组的结构特点以及GenBank上公布的全序列，用DNAMAN分别设计了涵盖整个基因组序列的3对引物，从接种口蹄疫病毒WFL株的细胞培养液中提取了病毒基因组RNA，采用RT-PCR方法和RACE法分别扩增了3条基因片段，并将扩增片段分别与T载体连接，在体外分别进行了5-半分子和3’半分子的构建。最后将5’半分子和3’半分子连接成基因组全长cDNA分子。经PCR鉴定、酶切鉴定及全长cDNA测序，证实成功构建了口蹄疫病毒wFL株基因组全长eDNA分子。序列分析结果表明，供试口蹄疫病毒基因组全长为8155nt，5＇UTR长1059nt；具有一个大的读码框，其核苷酸长度为6969nt。包括201aa的前导蛋白基因和2122aa的聚合蛋白基因；3＇UTR长127nt，包括34nt的polv（A）。     

Asia1型口蹄疫病毒含RSD受体识别位点感染性克隆的构建与病毒拯救

口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)具有高的突变率和很强的适应性,在环境条件变化时会迅速从准种种群中选择变异株来适应新的环境,这些变异株包括在RGD受体结合基序内部或附近氨基酸的替换。FMDV Asia1/JS/China/05株经不同宿主传代后产生含RSD和RDD受体识别基序的变异株,为了研究含RDD受体识别基序的FMDV在受体结合位点内1个氨基酸的变化是否影响感染性病毒子的产生,作者利用已构建的含RDD受体结合位点的FMDV Asia1/JS/China/05株的全长感染性cDNA克隆为骨架,采用融合PCR方法,构建了该毒株含RSD受体位点的全长cDNA克隆pFMDV-RSD。线性化的pFMDV-RSD重组质粒和表达T7RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,56 h后可观察到典型的FMDV致细胞病变效应。对收获的病毒分别进行序列测定、间接免疫荧光试验、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析,结果证实该毒株细胞受体位点1个氨基酸的替换不影响活病毒的拯救。该试验为进一步研究含RSD受体结合位点FMDV的生物学特性奠定了基础。     

猪瘟病毒Thiverval株3′非编码区插入片段对病毒拯救的影响

猪瘟病毒（CSFV）疫苗株Thiverval株与亲本病毒Alfort株相比,最明显的区别就是其3′-UTR含有一定长度的插入序列。本研究通过反向遗传学操作,构建了3′-UTR含有19nt、32nt以及插入片段完全缺失的CSFVThiverval株全长cDNA感染性克隆,将突变病毒基因组进行体外转录,利用BHK-21细胞转染、PK-15细胞传代增殖的方式成功的从3种重组突变感染性克隆中拯救出活病毒粒子,表明CSFV疫苗株3′-UTR插入片段并不影响病毒的拯救。通过3′-UTR二级结构模拟,发现疫苗株的插入片段导致3′-UTR空间构型发生改变、自由能升高、影响二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一。     

猪脑心肌炎病毒分离株BJC3全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定

本研究旨在建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的感染性克隆技术.利用RT-PCR分3段扩增出脑心肌炎病毒BJC3株的全基因组cDNA,依次克隆至低拷贝质粒pWSK29,构建出全长质粒pWSKBJC3/w,经体外转录和转染BHK-21细胞拯救病毒.结果表明,构建的全长cDNA克隆具有感染性,在BHK-21细胞上可拯救出病毒.拯救病毒(命名为rVBJC3W)在BHK-21细胞上的生长特性与其亲本病毒BJC3一致,并保持了对小鼠的致病性.本研究成功构建了中国第1株猪脑心肌炎病毒的感染性克隆,为深入研究其分子致病机制提供了必要的工具.     

O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立

本研究采用RT-PCR技术将O型口蹄疫病毒(FMDV)O/YS/CHA/05株全长基因组分4个cDNA片段进行克隆、拼接,构建了具有感染性的FMDV cDNA克隆pOKT7-OY/S/CHA/05.将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05在细胞外转录获得的病毒RNA转染BHK-21细胞,经培养可见典型的细胞病变(CPE).同时,将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,同样也观察到典型的CPE.对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记,即在病毒核酸的3 510位人工消除了Xba Ⅰ酶切位点.免疫电镜观察和间接免疫荧光试验进一步表明,拯救出了FMDV.病毒生长比较试验表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的增殖特性.本研究构建了O型口蹄疫病毒的感染性克隆并获得了拯救病毒,为深入研究FMDV的致病机理以及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台.     

猪生殖与呼吸综合征病毒5′非翻译区序列的反向遗传操作

以猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）北美株感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR获得在病毒基因组5′非编码区（5′UTR）和ORF1起始密码子之间插入NdeⅠ的全长克隆pTLNd4,并以此为基础将5′UTR替换为欧洲株的5′UTR,获得全长克隆pTLV8。以体外转录的RNA转染MARC-145细胞。结果显示,pTLNd4产生了细胞病变（CPE）,而pTLV8未产生。通过RT-PCR和Northern blot试验,分别对这2株突变病毒的基因组RNA复制和亚基因组mRNA转录水平进行了分析,同时还对pTLNd4进行了病毒学试验。证实,它们与亲本病毒无论从分子生物学水平或病毒学水平都无明显差异;pTLV8虽未产生CPE,但在病毒传代细胞中检测到了基因组RNA,说明替换不同基因型5′UTR的突变病毒虽然丧失了复制能力和感染性,但仍然能够提供病毒RNA合成所需要的顺式调控因子。     

猪瘟病毒C株(脾淋毒)全长cDNA分子几个突变位点的重组改造

采用RT-PCR、Nested PCR和Half-nested PCR技术从试验感染兔脾组织的总RNA中得到了猪瘟病毒(CSFV）C株全长cDNA的3个待改造片段，分别克隆于pMD18-T载体后进行测序。用重组技术分别从前期构建的5′半长cDNA或3′半长cDNA中替换F1、F3和F51，构建成2个新的半长cDNA，进一步连接成新的全长cDNA，经测序证实全长cDNA中3个致死性突变位点均得到改正。初步鉴定证明该全长cDNA具有感染性。为猪瘟病毒C株反向遗传操作系统的建立奠定了基础。     

猫杯状病毒2280株反向遗传系统的构建

为构建猫杯状病毒(FCV)2280株感染性克隆,本研究在FCV 2280株基因组5'末端和3'末端分别引入T7 RNA聚合酶启动子和丁型肝炎核酶(Hdv Rz)序列;并将FCV基因组中唯一的XbaⅠ限制性酶切位点序列进行同义突变作为遗传标记;将基因组分为3段分别进行RT-PCR扩增,通过酶切依次克隆于pOK-12载体中,构建FCV基因组全长cDNA重组质粒。以其为模板经体外转录制备其全长基因组RNA,并在5'末端加帽,转染CRFK细胞,24 h后出现典型的细胞病变。提取出现细胞病变的病毒液的总RNA制备cDNA模板,PCR扩增FCV遗传标记片段并进行XbaⅠ酶切鉴定分析,表明拯救的病毒为FCV重组病毒。而且拯救的病毒生长动力学与亲本病毒无明显差异。本实验为进一步研究FCV的生物学特性和致病机制奠定了基础。     

从全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒方法的研究

以携带猪瘟病毒Thiverval株全长cDNA克隆的pAC/F101/T1-7载体质粒为模板,在体外转录病毒基因组RNA,并转染PK-15和BHK-21细胞,通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,成功地在两种细胞中拯救出具有感染性的病毒粒子。同时,通过2种细胞转染效率的对比试验,成功建立了利用高转染效率的其它真核细胞作为病毒拯救的过渡细胞,然后再在猪肾细胞系上进行增殖的病毒拯救方式,极大提高了猪瘟病毒拯救的效率。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据PRRSV HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA.将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4.并在病毒cDNA 5′末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切位点用于线性化pHuN4;此外,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记.pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在Marc-145细胞中救获病毒.结果显示:救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异.利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100％,在感染后20 d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆,为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台.     

狂犬病病毒Flury-LEP株全基因组的克隆与序列分析

用RT-PCR法获得了涵盖狂犬病病毒Flury LEP株全基因组的3个重叠的cDNA片段,将获得的cDNA片段分别克隆至pMD18-T Simple载体上并进行序列测定,对测序结果进行拼接,得到全长cDNA序列,结果表明,Flury LEP株全长为11 924 bp,3-′UTR长58 bp,编码区核苷酸为11 723 bp,5-′UTR为131 bp。     

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株感染性分子克隆的构建

本研究以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株(野毒株)基因组为模板,用蛋白酶K法提取病毒基因组核酸dsRNA,在cDNA克隆的5'端上游引入了T7启动子序列,采用Long-accurateRT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了病毒基因组A节段与B节段全长cDNA。序列测定结果表明,基因组A节段全长共3267个核苷酸,包括5'及3'端的非编码区和两个部分重叠的开放阅读框,基因组B节段全长共2843个核苷酸,包括5'及3'端的非编码区和一个开放阅读框。将IBDV-Gx株的A节段全长基因组及B节段全长基因组分别克隆入pMD18-T载体,构建成pMD-A、pMD-B两个带有T7启动子的重组质粒。两个重组质粒线性化后,进行体外转录,然后共电转染于鸡胚成纤维细胞37℃培养72h并传代。收获的细胞传代培养物分别用RT-PCR、间接免疫荧光、蚀斑试验等方法进行鉴定,结果用RT-PCR扩增出了VP3及VP5基因片段,间接免疫荧光检测到了特异性的荧光抗体,蚀斑试验结果表明蚀斑形成单位为3×103PFU/mL。