高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp4的表达及其抗血清的制备

根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4（Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21（DE3）,诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析（Ni-NTA）纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB／c小鼠,抗血清ELISA效价达1：16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。     

我国猪群中TTV的鉴定及其分子流行病学分析

为了确定Torque teno virus(TTV)在我国猪群中是否存在及其感染情况,本研究利用套式PCR方法首次检测了来自广东、福建和江西等7个省份的258份血液样品和组织样品.结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性卒分别为37.6%和82.6%.两者的混合感染率为38.4%.挑选部分阳性样品用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分非编码区(UTR)片段,并将扩增出的部分UTR基因与已报道的TTV1和TTV2病毒UTR序列进行比较分析,同时我们选择了8份阳性样品进行了TTV1和TTV2的全长基因的扩增和克隆.分析结果显示TTV可分为TTV1和TTV2两大分支,其中我们分离获得的TTV1和TTV2之间的UTR核苷酸同源性分别为80.8%～98.5%和94.2%～100%,而与参考株相比同源性分别为82.7%～100%和95.5%～99.1%.本研究首次证实在我国猪群中存在TTV感染,提示我们对猪群感染的TTV是一个不容忽视的新病原.     

欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上清,并接种到MDCK细胞。待细胞病变明显时,进行血凝试验检测收集到的上清,测得血凝效价为1∶32。测定拯救病毒的全基因组序列,结果显示,在核苷酸序列上,拯救病毒与野生病毒完全一致。细胞病变情况显示,拯救毒株与野生毒株无明显差别。本研究成功拯救了欧洲类禽H1 N1亚型猪流感病毒,为猪流感病毒的致病机理、基因功能研究以及H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研发奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株最小免疫剂量的测定

将35头40日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)抗原及抗体均为阴性的健康仔猪,随机分成7组,每组5头,命名为XJ1~XJ7组。XJ1~XJ6组分别免疫PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株,接种剂量分别为102TCID50/头、103TCID50/头、104TCID50/头、105TCID50/头、106TCID50/头和107TCID50/头,XJ7组为对照组,按1mL/头剂量接种DMEM。各试验组在免疫后28 d,用3×104.0TCID50/头剂量感染HP-PRRSV HuN4第5代强毒,疫苗免疫和攻毒后观察和检测各组试验猪的免疫效果。结果表明:攻毒前XJ2-XJ6组PRRSV ELISA抗体在免疫后14 d全部转为阳性,XJ1组在免疫后21 d转为阳性,但维持在较低水平;XJ2-XJ6组针对标记基因NP49的特异性抗体在免疫后28 d转阳性。攻毒后对照组全部发病,且死亡2头,XJ1有4头发病,XJ2-XJ6组无发病和死亡,本研究结果表明PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株对仔猪提供免疫保护的最小免疫剂量为103TCID50/头。     

猪繁殖与呼吸综合征基因标记疫苗株NP49-ELISA鉴别诊断方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）rHN4-△25＋NP49株是新型基因标记弱毒疫苗候选株,为了配合对该基因标记疫苗免疫猪血清抗体的鉴别诊断,本研究以标记基因编码的NP49（新城疫病毒NP蛋白C末端49个氨基酸,即NP49）多肽作为包被抗原,建立标记疫苗免疫猪血清中NP49抗体的ELISA鉴别诊断方法。通过对NP49-ELISA工作条件的优化,结果显示NP49-ELISA的多肽抗原最适包被浓度为500ng／孔,被检血清最佳稀释度为1：40。利用ROC曲线法确定S／P临界值为0．2,该方法批内与批间重复试验的变异系数均小于10％,与几种常见猪病阳性血清无交叉反应,具有较好重复性和特异性。本研究建立的NP49．ELISA鉴别诊断方法为猪繁殖与呼吸综合征新型基因标记疫苗的临床应用提供了有力保障。     

表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆的构建及病毒拯救

为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。     

乙型脑炎病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ结构域抗原表位鉴定

为鉴定乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白I,II结构域抗原表位,本研究设计了一系列针对E蛋白的I、II结构域(1aa～296aa)部分重叠短肽,分别进行GST融合表达,用JEV阳性血清进行western blot和ELISA反应性筛选,获得了5个线性抗原表位分别为:E1(1FNCLGMGNRDFIEGAS16)、E10-4(77TGEAHNEK84)、E11-2(83EKRADSS YVCKQ94)、E19(145GTTTSENHGNYSAQVG160)和E33(257SQEGGLHHALAGAIVV272)。除E10和E19外,其它表位均为第一次通过实验方法确定的。将这5个融合蛋白对小鼠进行免疫,获得了高滴度的针对5个融合短肽的抗血清,研究证明了这些表位具有良好的免疫原性。本研究为乙型脑炎特异性诊断试剂及表位疫苗的开发奠定了基础。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒GP3蛋白糖基化位点突变株的构建及其生物学特性分析

为研究猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP3蛋白糖基化位点的作用,在弱毒疫苗株HuN4-F112感染性克隆的基础上,采用点突变的方法对GP3蛋白N29、N42、N50、N131位进行单点或多点组合突变去糖基化,构建了不同糖基化位点的单点和多点突变的PRRSV全长cDNA克隆,最终成功救获N29Q、N42Q、N50Q、N131Q、N29Q/N50Q、N29Q/N195Q六株含糖基化位点突变的病毒,而其余几种糖基化位点突变组合的全长cDNA未能拯救出病毒。对拯救毒株进行滴度测定及多步生长曲线绘制等特性分析,结果显示N29Q、N42Q、N50Q、N131Q位单个糖基化位点的缺失虽不影响子代病毒的产生但会不同程度地降低PRRSV感染细胞的能力,其中N50Q突变体较亲本下降6个滴度且生长明显延迟。多个糖基化位点同时缺失则会影响病毒的拯救,推测这些糖基化位点可能是产生具有感染性病毒粒子所不可或缺的。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒HuN4株nsp9、nsp10、nsp11对毒力影响的研究

为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒非结构蛋白对病毒毒力的影响,本研究通过反向遗传操作技术将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株的非结构蛋白编码区nsp9、nsp10、nsp11分别置换弱毒疫苗株HuN4-F112中的相应片段,经间接免疫荧光鉴定拯救的重组病毒,分别命名为rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112-nsp10、rHuN4-F112-nsp11,测序证实HuN4强毒nsp9、nsp10、nsp11片段正确替换入HuN4-F112骨架。拯救病毒在Marc-145细胞上的生长曲线显示,rHuN4-F112-nsp9和rHuN4-F112-nsp10在前24 h的复制速度明显高于rHuN4-F112-nsp11和拯救的母源毒rHuN4-F112,36 h后无明显差别。将拯救病毒以105TCID50剂量接种仔猪,对体温、临床症状、病毒血症、组织器官病变情况进行观察和检测。结果显示,拯救病毒rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112 nsp10、rHuN4-F112 nsp11在致病性、发热以及病毒血症强度上与rHuN4-F112无显著差异,提示单独nsp9、nsp10、nsp11对病毒致病性以及病毒在体内的复制无影响。     

2011年～2012年中国部分地区猪细环病毒在不同猪群中的流行病学调查及其与PCV2、PPV4或PRRSV的共感染分析

为了解猪细环病毒(TTV)在无明显临床症状的猪群和不同发病猪群中的感染情况,本实验于2011年～2012年期间共采集江苏、安徽、天津、湖北、上海、浙江6个省份的无明显临床症状的母猪血清共488份,发病猪群样品352份,包括发生PMWS的猪血清及组织样品203份,发生PRRSV感染的猪群样品105份,发生流产的初产母猪血清23份,以及流产胎儿组织样品21份.对无明显临床症状的猪群进行TTV1和TTV2的病原学检测,对发病猪群样品进行TTV和PCV2、PPV4、PRRSV共感染检测,并对40条TTV1和32条TTV2的UTR部分基因分群区域进行测序和进化分析.结果显示,在488份无明显临床症状的母猪和种公猪中,猪源TTV1和TTV2感染率较高,分别为41％和67％,二者混合感染率为28％.PMWS发病猪样品中PCV2阳性率高达75％,PCV2和TTV2的混合感染高达61％.在PRRSV为阳性的病料中,TTV2的阳性率高达86％.在初产母猪和流产胎儿中,TTV1和TTV2的感染率,以及与不同病毒的混合感染率均高于健康猪群的感染率.对基因序列的进化分析表明,TTV1主要可以分为8个基因群,TTV2可以大致分为4个基因亚群.本研究为研究猪源TTV的潜在致病力以及分子进化提供了进一步的资料.