欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上清,并接种到MDCK细胞。待细胞病变明显时,进行血凝试验检测收集到的上清,测得血凝效价为1∶32。测定拯救病毒的全基因组序列,结果显示,在核苷酸序列上,拯救病毒与野生病毒完全一致。细胞病变情况显示,拯救毒株与野生毒株无明显差别。本研究成功拯救了欧洲类禽H1 N1亚型猪流感病毒,为猪流感病毒的致病机理、基因功能研究以及H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研发奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒变异毒株的特性及其疫苗的研究现状

正猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的高死亡率的急性传染病。该病在我国发生较为严重,是严重危害我国养猪业的疫病之一。我国于20世纪70年代从匈牙利引进了伪狂犬疫苗Bartha-k61株,自20世纪90年代以来国内规模化猪场普遍使用该基因缺失疫苗,使猪伪狂犬病得到了很好的控制。但是,自2011年以来,一种由伪狂犬病毒变异毒株引     

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株最小免疫剂量的测定

将35头40日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)抗原及抗体均为阴性的健康仔猪,随机分成7组,每组5头,命名为XJ1~XJ7组。XJ1~XJ6组分别免疫PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株,接种剂量分别为102TCID50/头、103TCID50/头、104TCID50/头、105TCID50/头、106TCID50/头和107TCID50/头,XJ7组为对照组,按1mL/头剂量接种DMEM。各试验组在免疫后28 d,用3×104.0TCID50/头剂量感染HP-PRRSV HuN4第5代强毒,疫苗免疫和攻毒后观察和检测各组试验猪的免疫效果。结果表明:攻毒前XJ2-XJ6组PRRSV ELISA抗体在免疫后14 d全部转为阳性,XJ1组在免疫后21 d转为阳性,但维持在较低水平;XJ2-XJ6组针对标记基因NP49的特异性抗体在免疫后28 d转阳性。攻毒后对照组全部发病,且死亡2头,XJ1有4头发病,XJ2-XJ6组无发病和死亡,本研究结果表明PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株对仔猪提供免疫保护的最小免疫剂量为103TCID50/头。     

2008～2011年中国部分地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查

为了解2008~2011年中国部分地区猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)分子流行病学变化趋势,本实验室共采集福建省、江西省、广东省、安徽省、浙江省、河南省、河北省、广西壮族自治区、内蒙古自治区、上海市、江苏省和山西省共12个省(市、区)的健康猪群和发病猪群共452份样品,对其进行病原学检测,并通过扩增、克隆和测序共获得31株PCV2 ORF2基因编码序列。结果显示,452份样品中,有354份样品检测为PCV2阳性,感染率高达78.3%。对31株ORF2基因序列的分析和比对结果表明,31株PCV2均为PCV2b基因型,其中有21株归类于PCV1A/1B基因亚群,而10株为PCV1C亚群;对31株PCV2 ORF2编码氨基酸序列比对分析表明PCV2基因亚型具有其特异的氨基酸变异位点,这对于临床上区别PCV2亚型具有一定的指导意义。从基因水平上来说,自2008年以来中国以PCV 1A/1B亚群为主要流行致病株,但值得我们关注的是,PCV 1C亚群毒株从无到有并有逐渐增多的趋势,将来可能在PCV2的流行毒株中占据主要地位。     

猪繁殖与呼吸综合征基因标记疫苗株NP49-ELISA鉴别诊断方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）rHN4-△25＋NP49株是新型基因标记弱毒疫苗候选株,为了配合对该基因标记疫苗免疫猪血清抗体的鉴别诊断,本研究以标记基因编码的NP49（新城疫病毒NP蛋白C末端49个氨基酸,即NP49）多肽作为包被抗原,建立标记疫苗免疫猪血清中NP49抗体的ELISA鉴别诊断方法。通过对NP49-ELISA工作条件的优化,结果显示NP49-ELISA的多肽抗原最适包被浓度为500ng／孔,被检血清最佳稀释度为1：40。利用ROC曲线法确定S／P临界值为0．2,该方法批内与批间重复试验的变异系数均小于10％,与几种常见猪病阳性血清无交叉反应,具有较好重复性和特异性。本研究建立的NP49．ELISA鉴别诊断方法为猪繁殖与呼吸综合征新型基因标记疫苗的临床应用提供了有力保障。     

表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆的构建及病毒拯救

为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。     

伪狂犬病病毒IE180基因启动子缺失克隆的构建与鉴定

在本实验室已有的PRV JS-2012感染性克隆pBAC-JS2012及突变筛选菌株SW102-PRVBAC基础上,利用galk正筛选和卡那霉素的筛选标记基因,构建IE180两个拷贝启动子均删除的缺失克隆。利用同源重组将galk表达盒替换掉IE180TATA-box及左边297个碱基和右边172个碱基,经PCR鉴定和筛选获得阳性克隆SW102-galk。通过Western blot分析,IE180仍然存在表达。在此基础上再利用相同的方法将Kna筛选标记基因替换掉另一个拷贝IE180TATA-box及其左边134个碱基和右边309个碱基,经过PCR鉴定、Western blot分析以及转染后绿色荧光表达的分析,证实IE180不再表达。本研究成功筛选到IE180启动子缺失的阳性克隆pPRV-DIE180-BAC,为后期IE180缺失互补系统的构建及更深入的探究IE180的生物学功能奠定基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因缺失标记疫苗ELISA鉴别诊断方法的建立

为了配合（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）基因标记疫苗株（rHN4-Δ25＋NP49株）的临床抗体鉴别诊断应用,本研究以标记疫苗中缺失的25个氨基酸多肽作为包被抗原,通过对ELISA反应条件的优化,确定抗原最适包被浓度为500 ng/孔,血清最佳稀释度为1：40,同时确定其阴阳性临界值S/P判定标准为0.15,批内和批间重复实验结果显示其变异系数均低于10%,表明该方法具有良好的重复性。对临床血清检测结果显示与IDEXX试剂盒检测结果的符合率为94.84%,采用25 aa负标记ELISA方法检测HuN4-F112免疫猪血清,结果显示从免疫后21 d可检测25 aa特异性抗体,该抗体至少可持续存在126 d。本研究建立的ELISA检测方法为今后PRRSV基因工程标记弱毒疫苗株在临床鉴别诊断的应用提供了有利保障。     

2011年～2012年中国部分地区猪细环病毒在不同猪群中的流行病学调查及其与PCV2、PPV4或PRRSV的共感染分析

为了解猪细环病毒(TTV)在无明显临床症状的猪群和不同发病猪群中的感染情况,本实验于2011年～2012年期间共采集江苏、安徽、天津、湖北、上海、浙江6个省份的无明显临床症状的母猪血清共488份,发病猪群样品352份,包括发生PMWS的猪血清及组织样品203份,发生PRRSV感染的猪群样品105份,发生流产的初产母猪血清23份,以及流产胎儿组织样品21份.对无明显临床症状的猪群进行TTV1和TTV2的病原学检测,对发病猪群样品进行TTV和PCV2、PPV4、PRRSV共感染检测,并对40条TTV1和32条TTV2的UTR部分基因分群区域进行测序和进化分析.结果显示,在488份无明显临床症状的母猪和种公猪中,猪源TTV1和TTV2感染率较高,分别为41％和67％,二者混合感染率为28％.PMWS发病猪样品中PCV2阳性率高达75％,PCV2和TTV2的混合感染高达61％.在PRRSV为阳性的病料中,TTV2的阳性率高达86％.在初产母猪和流产胎儿中,TTV1和TTV2的感染率,以及与不同病毒的混合感染率均高于健康猪群的感染率.对基因序列的进化分析表明,TTV1主要可以分为8个基因群,TTV2可以大致分为4个基因亚群.本研究为研究猪源TTV的潜在致病力以及分子进化提供了进一步的资料.     

2010年国内部分省份猪场常见病毒性疾病的病原学调查

随着规模化养猪业的发展,传染性疾病越来越多,混合感染或多重感染十分普遍,给疾病的诊断和预防带来很大困难。本文将我们实验室2010年分别采自福建、广西、河南、上海、内蒙、浙江、江苏和山西等地发病猪场的185份病料,通过RT-PCR和PCR方法对其进行猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪繁殖障碍的猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、猪圆环病毒2（Porcine circovirus type 2,PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）、细环病毒2（Torque teno virus 2,TTV2）等病毒检测。结果表明在所检的病料中PRRSV、PCV2和TTV2的阳性率比较高,分别为49.2%、62.2%和95.1%。有些地方TTV2的阳性率高达100%;同时,还存在很普遍的PRRSV与PCV2、PRRSV与TTV2、PCV2与TTV2等混合感染,混合感染率分别为27.6%、45.4%、58.4%;以及PRRSV、PCV2与TTV2的三重感染率为24.9%。同时对部分PRRSV阳性病料的PRRSV GP5和nsp2基因分别进行测序,分析测序结果表明病料中的PRRSV的GP5和nsp2序列与PRRSV HuN4株的相应序列的亲缘关系分别在98.2%和96.2%以上,且在nsp2区域都存在30个不连续氨基酸的缺失,说明现在临床中所流行的PRRSV可能仍是与高致病性PRRSV基因型相似的病毒。通过本文可以及时了解当前养猪场的病毒性疾病的流行情况,为猪场病毒性疾病的防控提供依据。