高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp4的表达及其抗血清的制备

根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4（Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21（DE3）,诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析（Ni-NTA）纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB／c小鼠,抗血清ELISA效价达1：16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。     

仔猪大肠杆菌病防治

仔猪的腹泻是制约猪场猪只成活率高低的关键问题，其中以仔猪大肠杆菌病引起的黄白痢和水肿病最为常见。本文介绍了仔猪大肠杆菌病发病诱因，临床症状及防治措施，以期对实际生产提供一些帮助。     

奶牛乳房炎疫苗的研究进展

乳房炎（Mastitis）是乳腺受到物理、化学刺激，尤其是微生物侵袭所发生的一种炎性变化，给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失。引起奶牛乳房炎的常见致病菌有金黄色葡萄球菌属、链球菌属、大肠杆菌属等约140多种，当外界病原菌进入乳房，突破奶牛的免疫防御体系，定植，感染，就会形成乳房炎。     

快速检测A型流感病毒的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法的建立

根据A型流感病毒基质蛋白（matrix protein,M）基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan BHQ探针,建立快速检测A型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆A型流感病毒M基因靶序列并将其连入pMD-18T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.998。检测结果显示,该方法的灵敏度可达10 copies/μL或1 EID50病毒且特异性良好,除A型流感病毒外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪输血传播病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。对40份实验感染样品的检测结果表明,该方法与病毒分离结果一致,比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高,特异性更强。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒GP3蛋白糖基化位点突变株的构建及其生物学特性分析

为研究猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP3蛋白糖基化位点的作用,在弱毒疫苗株HuN4-F112感染性克隆的基础上,采用点突变的方法对GP3蛋白N29、N42、N50、N131位进行单点或多点组合突变去糖基化,构建了不同糖基化位点的单点和多点突变的PRRSV全长cDNA克隆,最终成功救获N29Q、N42Q、N50Q、N131Q、N29Q/N50Q、N29Q/N195Q六株含糖基化位点突变的病毒,而其余几种糖基化位点突变组合的全长cDNA未能拯救出病毒。对拯救毒株进行滴度测定及多步生长曲线绘制等特性分析,结果显示N29Q、N42Q、N50Q、N131Q位单个糖基化位点的缺失虽不影响子代病毒的产生但会不同程度地降低PRRSV感染细胞的能力,其中N50Q突变体较亲本下降6个滴度且生长明显延迟。多个糖基化位点同时缺失则会影响病毒的拯救,推测这些糖基化位点可能是产生具有感染性病毒粒子所不可或缺的。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株致弱毒株特异性抗原表位的鉴定

通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virtls,Hp-PRRSV）HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2（Nonstnduralprotein2）蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2蛋白存在4处氨基酸点突变,针对每个突变点分别人工合成编码短肽的核苷酸序列,经原核表达后进行Western blot分析。结果表明表达的融合蛋白F65-11（^749KGEPvsdqpak^759）能够特异性的与HuN4-F40、HuN4-F65和HuN4-F112感染猪的血清发生反应,而与HuN4 F5感染猪的阳性血清和CH-1a株阳性血清不发生反应,证实第4个氨基酸点突变（S754）处存在一个免疫优势抗原表位。将该表位肽段由N端和C端逐步缩短继续鉴定,当N端缩短到第5个氨基酸（^754SDQPAK^759）C端缩短到第3个氨基酸（^749KGEPVSDQ^757）时,表达的融合蛋白不能与PRRSV阳性血清反应,最终推测该抗原表位必需氨基酸为^753VSDQ^756。选取GenBank中提交的部分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp2氨基酸序列,对该表位氨基酸所在位置进行序列比较,分析结果显示位于Nsp2蛋白749→759位氨基酸序列高度保守,F65—11变异位点C^754→7^754为HuN4株系列传代毒株所特有。本研究结果证实抗原表位F65—11可以作为鉴别HuN4-F112弱毒疫苗所诱导产生的特异性抗体的候选抗原。     

金黄色葡萄球菌α溶血素的原核表达及其生物活性分析

摘要：α溶血素（α-Hemolysin, α-HL）是金黄色葡萄球菌的主要毒力因子之一，利用PCR技术从金黄色葡萄球菌临床分离株扩增出编码α溶血素的基因(α-HL)，经克隆筛选和测序鉴定后，构建成该基因的原核表达质粒pET32a+-α-HL。经诱导表达后，进行SDS-PAGE分析，结果表明:α-HL在大肠杆菌中已融合表达,融合蛋白的分子量为53kD。溶血实验证明该融合蛋白具有较强的溶血作用,其溶血效价达2.26×104 HU/mg,表明表达产物具有生物活性,这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

本研究设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的特异性引物和TaqMan荧光探针，建立了一种检测PRRSV的快速、敏感、特异和重复性好的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在检测10^1拷贝／μL～10^7拷贝／μL模板范围内具有良好的线性关系，比常规RT—PCR更敏感，可分别检测最少为10拷贝的阳性标准品和1TCID。病毒。用建立的方法检测高致病性变异株HuN4第5代和第65代体外传代细胞毒人工感染6周龄～7周龄仔猪后的0h、3h、5h、7h、10h、14h、21h血清样品，以及HuN4第5代病毒攻击仔猪21d后迫杀的猪的脑、心、肝、脾、肺、肾和淋巴结等组织样品病毒含量，结果发现HuN4第5代病毒感染仔猪3d后在血液中迅速复制，并在感染后7d血清病毒含量达到最高峰，接近10^10拷贝／mL。攻毒21d后，上述内脏组织中肺脏含毒量最多，接近10^9拷贝／g。HuN4第65代病毒在人工感染猪后21d的血清病毒含量最高，达到10^6拷贝／mL血清。     

猪苏氨酸营养的研究进展

苏氨酸作为人和动物体内的必需氨基酸之一，在医药、食品和饲料添加剂工业中有着举足轻重的作用。其中用于医药15％，食品工业5％，而80％用于饲料行业。近年来，随着合成赖氨酸、蛋氨酸在配合饲料中的广泛应用，苏氨酸逐渐成为影响动物生产性能的主要限制性因素，成为最低成本配方中影响成本的关键营养素。     

应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌

为建立一种在分子水平快速检测乳房炎主要病原菌的方法,根据GenBank已发表的序列设计了3对特异性引物,结果可同时检测奶牛乳房炎的3种主要病原菌:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌.其特异性为100%,敏感性检测的最低浓度为:1.25×103 cfu/mL.