猪繁殖与呼吸综合征病毒凝胶层析纯化方法的建立与初步应用

为了高效分离纯化并获得结构完整的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),用于PRRSV的形态学研究、动物免疫以及制备高质量疫苗,本试验在Marc-145细胞中增殖PRRSV HuN4株,经超滤浓缩后,分别采用氯化铯密度梯度离心方法和凝胶层析技术纯化PRRSV。结果显示,与氯化铯密度梯度离心相比,凝胶层析纯化可以得到纯度更高、结构更完整的病毒粒子。将凝胶层析纯化得到的PRRSV免疫小鼠制备多抗,间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,多抗血清可与PRRSV发生特异性反应;酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示,抗体效价可达到1∶25 600以上,纯化的病毒具有良好的免疫原性。结果表明,应用凝胶层析技术可得到高纯度、结构完整的PRRSV粒子,且纯化后PRRSV能够诱导良好的免疫应答,本试验结果可为PRRSV的纯化提供参考。     

口蹄疫病毒vp3-间接免疫荧光诊断方法的建立

口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP3为保守区,各血清型间差异不大,因此以其为抗原建立一种快速、有效、操作简便的FMDV自然感染动物与疫苗免疫动物鉴别诊断方法.PCR扩增口蹄疫病毒结构蛋白VP3基因,克隆到杆状病毒表达系统转移载体pFastBacHT-A中,转座DH10感受态细胞,获得阳性克隆.提取基因组Bacmid,转染Sf9昆虫细胞,获得含口蹄疫病毒结构蛋白基因VP3基因的重组杆状病毒.以被检测血清为一抗,以FITC标记的兔抗牛IGg为二抗,通过反应条件的优化,建立间接免疫荧光检测方法,并检测血清44份,与EIASA方法符合率为90.9%.     

抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

用纯化的Asia1型口蹄疫病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)筛选,有限稀释法克隆,获得了2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H6、5G3,其细胞培养上清效价分别为1:64和1:128,小鼠腹水效价分别为1×10~(-4)和8×10~(-3);ELISA和IFA结果显示,2株单抗仅与Asial型口蹄疫病毒反应,不与O型口蹄疫病毒反应,表明它们均为抗Asial型口蹄疫病毒的型特异性单克隆抗体。westem blot结果显示,2株单克隆抗体均不与全病毒抗原反应,表明它们所针对的抗原表位均为构象表位。相加ELISA试验表明,两株单抗识别不同的抗原表位。经硫氰酸盐洗脱法测定,3H6和5G3的相对亲和力指数分别为1.0 mol/L和1.5 mol/L。这2株单抗的获得为建立口蹄疫病毒检测方法提供了强有力的工具。     

O型和Asia1型口蹄疫病毒感染RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank中O型和Asia1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的vp3、vp1和2A基因序列,并与其它血清型FMDV的对应基因序列进行比较,设计用于扩增O型和Asia1型FMDV vp1基因的特异性引物,建立O型和Asia1型FMDV RT-PCR鉴别诊断方法。本方法首先用通用型引物进行RT-PCR,确定是否为FMDV感染,然后用特异性引物鉴别O型或Asia1型FMDV的感染。用vp1基因序列分析进行符合性试验,验证了该方法所具有的特异性和敏感性。本方法可用于O型和Asia1型FMD的快速诊断及流行病学调查。     

高致病性PRRSV感染对仔猪骨髓细胞影响的初步鉴定

为了研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染对仔猪骨髓细胞的影响,本研究体外培养仔猪骨髓细胞后感染HP-PRRSV,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测骨髓细胞生长情况,并通过流式细胞分析技术检测病毒感染骨髓内细胞的类型。实验结果显示:HP-PRRSV HuN4感染骨髓细胞72h后病毒感染率达到峰值,骨髓细胞存活率显著下降;流式细胞分析结果显示,HP-PRRSV感染的骨髓细胞为髓系前体细胞(SWC3~LSWC8~-)与巨噬细胞(SWC3~HSWC8~-)。本实验结果表明:HP-PRRSV在骨髓内除能够感染巨噬细胞外,还能感染髓系前体细胞,引起仔猪骨髓损伤并影响机体的正常免疫反应。本研究为进一步探究HP-PRRSV感染机体免疫抑制机制奠定了前期基础。     

马传染性贫血病毒免疫学研究进展

马传染性贫血病病毒(equine infctious anemiavirus EIAV)导致马持续性感染和反复病毒血症,与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属,二者有很多相似的特性[2].EIAV是遗传结构最简单的慢病毒,其感染的潜伏期只有几天至几周,而且在EIAV感染过程中新的抗原变异株的出现与疾病的反复发作相关,这使EIAV有可能作为研究HIV-1分子致病机理及免疫机制的动物模型[3].     

感染性分子克隆衍生的马传染性贫血病毒的免疫学特性

将马传染性贫血病毒驴白细胞毒疫苗(DLA—EIAV)、DLA—EIAV感染性分子克隆衍生毒(vOK8226)以及强弱毒嵌合毒(vOKVltr)分别接种健康马，并于接种后第220d，用EIAV强毒辽宁株(L-EIAV)攻击，观察临床变化，并测定接种后各结构蛋白的抗体变化。结果发现，攻毒后，2匹非免疫对照马和克隆衍生毒接种组中的1匹马体温均出现典型的稽留热并死亡，死亡马呈现典型的马传染性贫血的病理组织学变化，其他免疫马未见任何临床变化；在攻毒后第450d剖杀所有存活马，也未见任何病理组织学变化。抗体检测结果表明，免疫接种后攻毒前各组p11和p9抗体均检测不到，嵌合毒接种组p15、p26和gp45抗体水平高于其他组。攻毒后非免疫对照马体内抗p9、p11、p15、p26和gp45抗体均显著升高，并持续至死亡；嵌合病毒接种马体内各结构蛋白抗体水平与攻毒前没有显著变化，克隆衍生毒接种马体内各结构蛋白抗体水平比攻毒前有所升高。通过临床观察、病理组织学检测以及攻毒后各结构蛋白抗体记忆反应情况分析，置换了强毒LTR的DLA—EIAV感染性分子克隆衍生毒(强弱毒嵌合病毒)免疫马能够抵抗马传染性贫血病毒强毒的攻击，获得完全保护，而DLA—EIAV感染性分子克隆衍生毒免疫马未能完全抵抗强毒的攻击。     

猪源凋亡相关基因SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法的建立

为检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的猪胸腺中凋亡相关因子的变化,本研究针对猪TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3基因及内参β-actin基因设计特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3基因的SYBR Green Ⅰ qRT-PCR方法.结果显示,该方法线性关系好(R2≥0.998),敏感性高,初始模板的检出下限为10拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,批内、批间重复试验的变异系数均小于3％,具有良好的重复性.本研究为细胞凋亡相关因子变化趋势的研究提供方法.     

HP-PRRSV HuN4株及其致弱过程中的不同代次病毒对仔猪外周免疫器官及肺脏的损伤

为了研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株在其致弱过程中对仔猪外周免疫器官及肺脏损伤的变化,试验分别采用HuN4F5及其致弱代次F15、F23、F30及HuN4弱毒疫苗F112感染30日龄PRRSV抗原抗体阴性健康断奶仔猪,每天进行体温测定及临床症状观察,并在感染后0,3,5,7,10天检测病毒血症情况。病毒感染后10天剖杀试验猪,观察外周免疫器官及肺脏的病理变化并对肺脏和主要外周免疫器官病毒载量进行测定。结果表明:HuN4 F5、HuN4 F15组在临床症状、病毒血症、外周病毒载量及病理变化方面都明显比其他组严重,HuN4 F23组发病明显减轻,HuN4 F30组、HuN4 F112组无明显发病特征,与空白对照组无明显差异。说明HP-PRRSV HuN4株在致弱过程中,传代至30代时毒力发生显著减弱。     

一株血清31型猪链球菌的分离鉴定及生物学特性研究

为了检测2015年12月黑龙江省萝北市某猪场2只发病猪的病原,本研究将发病猪迫杀后无菌采集的脑组织于血平板培养基上划线进行细菌分离培养,结果显示在血平板培养基上形成灰白色、半透明、边缘整齐的带有草绿色狭窄溶血环的光滑型圆形小菌落,初步鉴定为革兰氏阳性双球及短链球菌。经猪链球菌(S.suis)种PCR鉴定及血清凝集试验分型鉴定该菌为S.suis血清31型,其毒力基因型为gdh+、mrp-、ef-、sly-、89KPaI-,将其命名为15LB12株。经MLST分型分析,其等位基因图谱为1、35、2、7、1、52、28,经与ST型数据库比对,显示其为ST421。小鼠致病性试验显示,该S.suis可导致小鼠发病及死亡,死亡率为12.5%,并且其可突破血脑屏障引起化脓性脑炎。本研究为了解S.suis的遗传多样性、微进化和毒力提供了新的数据。