口蹄疫病毒O、A、Asia I型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

[目的]建立一种从田问样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA).[方法]采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体.将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and Asia I/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带.经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒.[结果]本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50(1:128倍稀释乳鼠毒)的病毒量.同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性12炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、Asia I型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%.试剂盒在4℃下可保存6个月.[结论]本试验研发的12蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值.     

羊口疮病毒疫苗株与野毒株VIL-10基因的比较分析

试验旨在比较分析羊口疮病毒（orf virus,ORFV）VIL-10基因在疫苗株和野毒株之间的差异特征。参照GenBank中公布的ORFV NZ2株的VIL-10基因序列设计并合成1对特异性引物,分别以疫苗株和野毒株提取的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ORFV的VIL-10基因全序列并进行测序,应用生物信息学相关软件分析基因的核苷酸、氨基酸变异情况及蛋白结构。结果显示,本试验测定的疫苗株和野毒株VIL-10基因核苷酸序列同源性为94.4%,差异主要是单个碱基的突变,其中疫苗株在132~134 bp核苷酸序列出现缺失;氨基酸序列同源性为92.5%,出现了15个氨基酸位点的突变,其中疫苗株第42位氨基酸天冬酰胺出现缺失;蛋白质在一级结构及理化性质、二级结构、三级结构、抗原表位参数及有无信号肽之间均存在一定程度的差异,而疫苗株和野毒株编码的蛋白质均无跨膜结构域。系统进化树分析结果表明,本试验测定的野毒株与疫苗株属于不同分支,遗传关系较远。研究结果提示,野毒株与疫苗株的VIL-10基因发生较明显的变异,这些变异可能与ORFV疫苗株的毒力致弱有关。     

猪瘟病毒E2蛋白在酵母中分泌表达条件的优化

影响外源基因在毕赤酵母中表达的因素很多，除了基因序列本身的内在特性外，表达条件对外源基因的表达量的高低也有着极显著的影响。本文对猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中不同的时间、不同的诱导型、不同的pH、不同的诱导剂量等方面表达量的差异进行了详细对比研究。结果表明，诱导后72～96h，重组E2蛋白的表达量最高。与单纯甲醇诱导相比，甘油／甲醇诱导后的表达量明显提高。在pH7．5和pH8．0表达E2蛋白是比较合适的。甲醇浓度在3％左右时E2蛋白的表达量较高。     

O型口蹄疫病毒免疫层析试纸条检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测O型口蹄疫病毒（FMDV）抗原的胶体金免疫层析方法,将兔、豚鼠抗O型FM-DV多抗用DEAE-Sephose层析柱纯化。胶体金标记O型豚鼠口蹄疫抗体,形成金标探针并将其喷涂于玻璃纤维上。兔抗O型FMDV抗体和羊抗豚鼠IgG分别标记于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带,各部件按顺序装配形成快速诊断试纸条。如果待检样品中含有O型FMDV,它将与玻璃纤维上的胶体金探针和兔抗O型FMDV抗体形成夹心复合物,并在检测带被固定,沉集反应形成肉眼可见的红色条带。在田间试验中,53份试验样本分别用试纸条和反向间接血凝试验进行检测,2种方法的阳性率分别为95.45%和90.91%。评价试验证实,本研究建立的胶体金免疫层析方法简便、快速,具有良好的特异性和敏感性,非常适于基层兽医实验室诊断时使用。     

高致病性猪蓝耳病病毒GS/LZh/07株的分离、鉴定及其非结构蛋白Nsp2基因特性分析

将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,发现所扩增到的Nsp2基因有90个核苷酸的缺失。序列比对结果表明：该分离病毒Nsp2基因与经典毒株PRRSV-ch-1a核苷酸同源性为83.0%,氨基酸同源性为72.7%;与高致病性变异毒株NX和SD核苷酸同源性为95.5%,氨基酸同源性为90.9%,可见该毒来源于2006-2007年流行毒株,说明高致病性猪蓝耳病变异病毒已经在甘肃省存在。该毒株的成功分离为高致病性猪蓝耳病流行病学调查分析提供数据,也为预防控制该病积累了资料。Nsp2的特性分析为揭示高致病性猪蓝耳病PRRSV在甘肃省的流行特点提供参考。     

猪瘟病毒及其致病机制研究进展

猪瘟（CSF）是猪的一种高度接触性传染病，该传染病可分为急性、亚急性、慢性、非典型性和不明显型。急性CSF由强毒株引发，一般导致高发病率和死亡率，而弱毒病毒感染则表现不明显。由于疫苗的广泛应用，有效地控制了猪瘟的大流行，减少了急性死亡。但从20世纪80年代以后，临床症状不典型且病程变长的非典型性猪瘟（或慢性猪瘟）成为该病的主要发生形式，持续感染普遍存在，疫苗的预防效果明显下降，使猪瘟防制遇到了新的困难。以目前人类对猪瘟的认识水平，尚难以从分子水平解释这一新变化的成因，这是因为对猪瘟病毒致病机理及其分子基础的认识深度不够。就此，文章综述了猪瘟及猪瘟病毒研究进展，主要涉及CSFV生物学特性、致病机制及其防控，希望能为猪瘟防控提供新的思路和对策。     

猪水疱病病毒致病和免疫的分子基础

猪水泡病病毒（Swinevesiculardiseasevirus，SVDV）属于小RNA病毒科（Picornaviriclae）肠道病毒属（Enterovirus），其抗原特性与柯萨奇病毒B5（CoxsackievirusB5，CVB5）关系密切，被认为是CVB5的一个猪变种或亚种。SVDV只有一个血清型，但对其分离株进行系统发生分析可进一步分为4个抗原群或基因群。     

猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。     

PCV2衣壳蛋白肽段的表达及其血清抗体间接ELISA检测方法

利用可溶性重组PCV2-Cap蛋白肽段为抗原,建立PCV2血清抗体间接ELISA诊断方法(rhcap-ELISA)。将PCV2cap基因中含主要表位的片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至18℃诱导,获得大小为34 ku的可溶性融合蛋白。Western blotting试验证实该融合蛋白具有很强的免疫学活性,通过亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化。用融合表达的可溶性蛋白肽段作为抗原,建立猪圆环病毒(PCV2)血清抗体间接ELISA诊断方法。该方法的交叉反应结果表明,重组抗原与PRRSV、CSF、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rhcap-ELISA和商品化的同类试剂盒(PCV2-Ab-Kit)检测137送检血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为79.56%和83.21%。因此,rhcap-ELISA猪圆环病毒抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合于在大规模的PCV2血清抗体的检测工作中使用。