长角血蜱肠道细菌的分离与鉴定

为深入研究肠道细菌在蜱的生理学和传播病原上的作用,本研究进行了长角血蜱肠道细菌的分离鉴定。按照细菌传统分离方法并结合16S rDNA测序鉴定,获得7个分离株,这些菌株分别属于显核菌属(Caryophanon sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、微杆菌属(Microbacterium sp.)和短杆菌属(Brevibacterium sp.)5个菌属。     

细胞渗透肽在动物医学领域的应用

随着疫苗及药物的发展,新型传递系统的研究和应用日益受到关注。细胞渗透蛋白或肽(CPPs)作为一种传递系统,具有穿过哺乳动物细胞膜的能力,且不受能量和受体的约束。细胞渗透肽已经成功地携带多肽、荧光标记蛋白、螯合剂、DNA、反义核酸、脂质体等物质,实现体内外的跨膜递送,并可导入几乎所有的组织和细胞内。细胞渗透肽作为转运载体在药物传递、治疗性分子转运和疫苗增效方面都显示了重要价值,已成为国内外相关研究的一个热点。论文对细胞渗透肽的种类和在动物医学方面的应用做了综合性的概述,以此促进细胞渗透肽能在将来的动物医学方面有更广阔的应用前景。     

抗菌肽M50基因在Bac-To-Bac杆状病毒系统中的表达

将镰形扇头蜱体内的抗菌肽M50全长基因,克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-M50,并将其转化DH10Bac细胞后,得到重组穿梭质粒reBacmid-M50,再转染到sf9昆虫细胞,进行M50重组蛋白的表达,用Western blot和间接免疫荧光等方法对表达的蛋白进行鉴定。结果表明M50基因在Bac-To-Bac杆状病毒系统中成功表达。带His标签的重组蛋白分子量约为15 kDa,在昆虫细胞中表达的M50蛋白能被抗原核表达的M50蛋白的血清识别,也能被标签His单抗识别。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP3基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV Gx株进行培育，通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱，对其结构蛋白VP3基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析，从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律。对不同代次细胞毒序列分析的结果表明，细胞毒在第8代以前，VP3基因序列没有改变，与标准超强毒HK46株氨基酸同源性达99％以上；细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变；10代毒VP3基因与标准弱毒P2株氨基酸序列同源性达100％；细胞适应毒传至20代，其VP3基因序列不再改变。从而说明，vvIBDV Gx株在致弱过程中，VP3基因也随之改变。     

亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白p36基因的RNA干扰研究

本研究利用RNA干扰技术研究亚洲璃眼蜱p36基因在其生长、发育、繁殖方面的生物学功能。通过注射p36基因的dsRNA成功实现了该基因的表达沉默,干扰组表达量下降了99%。蜱p36基因沉默后,24 h的吸附率下降了50%,饱血率下降了55.5%,卵孵化率下降了100%。结果表明p36基因在亚洲璃眼蜱吸血和繁殖中具有重要作用。     

桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠治疗作用及其对血清中细胞因子含量的影响

建立小鼠弓形虫病模型后,将小鼠随机分成6组,统计小鼠存活率及时间,再应用ELISA检测血清中IFN-γ、IL-2等细胞因子水平,以检测桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠的治疗效果及对小鼠血清中IFN-γ、IL-2细胞因子水平的影响。结果表明,桦褐孔菌多糖中剂量组小鼠存活率最高;桦褐孔菌多糖的高、中剂量组IFN-γ水平极显著高于其他各组(P<0.01),高剂量组IL-2水平与其他各组比较差异极显著(P<0.01);除感染组外,其余各组IFN-γ、IL-2均在第6天出现峰值。说明桦褐孔菌多糖中剂量治疗弓形虫感染小鼠效果最好,并且中剂量可使小鼠血清中IFN-γ、IL-2值升高到适当水平,有效改善弓形虫感染对小鼠的伤害。     

亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白P36的分子鉴定及重组表达

为了解蜱吸血和病原传播的分子机制,本研究从亚洲璃眼蜱唾液腺中克隆获得一个编码免疫抑制蛋白P36的同源性基因,该基因全长924bp,编码区为708bp,预测的编码蛋白包含235个氨基酸,分子量为27ku。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与美洲花蜱和安氏革蜱唾液腺中的免疫抑制蛋白P36高度同源。RT-PCR分析表明,该基因在未吸血成蜱中没有表达,但吸血后表达。将目的基因与载体pGEX-4T-1连接后转化BL21表达菌,经诱导后得到GST融合重组蛋白。该实验结果为进一步研究P36奠定了基础。     

转基因羊对体表吸血蜱的生物学特性影响

本文对转基因动物养殖基地的3种不同的转基因山羊(转人β-干扰素、人抗凝血酶Ⅲ和乙肝表面抗原基因)与野生型山羊体表吸血蜱的生物学特性进行比较研究,分析了蜱的种类、感染率、感染强度、饱血雌蜱的产卵量和幼蜱孵化率,以及第二代蜱实验条件下生长发育数据,从而探索转基因羊对环境生物的安全评估。结果发现,与野生型羊群比较,转基因羊群对体表吸血蜱的侵袭能力和吸血后各项生长发育的生物学特征无显著影响。     

CIAV VP1 C端基因片段克隆及其在大肠杆菌中的表达

将从组织病料中提取到的鸡传染性贫血病毒核酸经PCR扩增得到vp1基因,用DNAStar分析软件分析预测VP1的抗原表位,它们主要位于VP1氨基酸序列的第1～95、134～303、327～435位,分别命名为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区.欲表达C端基因片段,含部分Ⅱ区和完整的Ⅲ区.把vp1基因克隆到表达载体pGEX-6p-1上,用BamHI消化重组表达质粒pGEX-vp1,回收含C端基因的大片段,自连转化大肠杆菌感受态细胞,得到重组质粒pGEX-vp1(C).重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果VP1 C端基因片段在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为49kDa.蛋白纯化后作ELISA检测,可与阳性血清反应.本研究为研制应用重组抗原制备ELISA诊断试剂盒奠定了基础.     

传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP3基因的克隆与原核表达

利用PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP3基因，将其克隆到表达载体pPRO^EX-HTa中，获得重组质粒命名为VP3／PA，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，插入的位置、大小和读码框均正确。SDS—PAGE检测表明，经重组质粒VP3／PA转化、诱导的受体菌E．coli DH5 α能表达结构蛋白VP3基因，约33 Ku，表达量达到了茵体总蛋白的33．9％，经Western blot等检测表明，诱导表达的抗原蛋白能与vvIBDV阳性血清发生特异性反应。这为IBDV血清学诊断方法的建立打下了基础。