高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据PRRSV HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA.将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4.并在病毒cDNA 5′末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切位点用于线性化pHuN4;此外,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记.pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在Marc-145细胞中救获病毒.结果显示:救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异.利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100％,在感染后20 d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆,为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30株CHsx1401感染性克隆的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响全球养猪业的一种重要病原。近年来,国内新出现的类NADC30毒株导致临床PRRS疫情再次出现。本研究旨在构建PRRSV类NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆,以期为研究该类毒株遗传变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制奠定基础。将类NADC30毒株CHsx1401全长基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,分别将扩增片段克隆到pJET1.2载体构建中间质粒,将4个克隆依次连接并克隆到改造后的低拷贝质粒载体pWSK29中,构建全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,并在全长cDNA克隆的C与D片段之间通过同义突变(T11582G)引入AscⅠ酶切位点,作为遗传标记,用于区分拯救病毒与亲本病毒。采用脂质体LTX将全长cDNA克隆质粒转染至MARC-145细胞拯救病毒。结果表明,成功构建出全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,转染MARC-145细胞后传至第二代可观察到明显的细胞病变(CPE)。经间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定鉴定结果表明,从全长cDNA克隆可拯救出病毒。拯救病毒(RvCHsx1401)在MARC-145细胞上可稳定传代,增殖动态与亲本病毒相似,在MARC-145细胞上各时相的病毒滴度略低于亲本病毒。本研究构建的类NADC30毒株CHsx1401的全长cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒;拯救病毒与亲本病毒的体外增殖特性相似,为研究该毒株的变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制提供了技术平台。     

5'端非病毒核苷酸对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆拯救的影响

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5'端非病毒核苷酸对感染性克隆拯救的影响,优化PRRSV反向遗传操作平台,本试验构建了含有CMV启动子的PRRSVJXA1-R株全长克隆质粒,在CMV启动子的下游引入锤头核酶序列,并在PRRSV基因组的5'端上游和锤头核酶下游之间引入非病毒核苷酸,分别构建成5'端含有非病毒核苷酸GG和GCTAGC的PRRSV全长感染性cDNA克隆Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV。新构建的两株克隆质粒直接转染BHK-21细胞拯救,48h后用间接免疫荧光检测病毒M蛋白,结果表明两株克隆均可拯救成活,测定Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV转染上清的病毒毒价分别为3.0和1.25TCID₅₀/mL,拯救病毒在Marc-145细胞上传3代后均稳定在6.5TCID₅₀/mL,病毒滴度无明显差异。本研究成功构建了两株5'端上游含有非病毒核苷酸的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆,表明PRRSV的5'端上游含有两个非病毒核苷酸GG拯救效率较高,且5'端的病毒外源核苷酸对拯救的影响仅存在于拯救的最初阶段。     

猪脑心肌炎病毒分离株BJC3全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定

本研究旨在建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的感染性克隆技术.利用RT-PCR分3段扩增出脑心肌炎病毒BJC3株的全基因组cDNA,依次克隆至低拷贝质粒pWSK29,构建出全长质粒pWSKBJC3/w,经体外转录和转染BHK-21细胞拯救病毒.结果表明,构建的全长cDNA克隆具有感染性,在BHK-21细胞上可拯救出病毒.拯救病毒(命名为rVBJC3W)在BHK-21细胞上的生长特性与其亲本病毒BJC3一致,并保持了对小鼠的致病性.本研究成功构建了中国第1株猪脑心肌炎病毒的感染性克隆,为深入研究其分子致病机制提供了必要的工具.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株基因组全长感染性克隆的构建

利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3'端覆盖口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBlueseriptSK+载体上.利用融合PCR扩增到基因组5'端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp),并将其连接至pGEM-T载体.最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo(+)中构建该病毒株的全长cDNA克隆.以构建的FMDV Asial/JS/China/2005株全长cDNA为模板,使用TTRNA聚合酶在体外转录得到病毒RNA,通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒.对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒.该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础.     

PRRSV强弱病毒株嵌合感染性克隆的构建及鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)与致弱PRRSV的重组病毒,本研究在PRRSV致弱株APRRS的全长感染性克隆pAPRRS与HP-PRRSV感染性克隆pJX143的基础上,利用SOE-PCR技术将强弱毒的nsp2区域进行互换,构建了nsp2基因替换的强弱毒PRRSV嵌合感染性克隆.将构建的嵌合克隆转染MA104细胞,4d后观察到典型的细胞病变.通过RT-PCR和间接免疫荧光证明获得了强弱病毒株之间nsp2基因互换的嵌合病毒.这些嵌合病毒的构建和相应反向遗传操作平台的建立,为进一步研究HP-PRRSV的致病机制及相关疫苗的研发奠定了基础.     

鹅源副黏病毒NA-1株全长cDNA克隆的构建及鉴定

应用cRACE法扩增鹅源副黏病毒NA-1株cDNA 5'末端.参照Peter等的方法设计引物,扩增鹅源副黏病毒NA-1株cDNA的3'末端.根据GenBank上发表的鹅源副黏病毒序列设计6对引物,应用RT-PCR方法分6段扩增此病毒结构基因序列,并将其连接完成后与连接有鹅源副黏病毒NA-1株末端序列的转录载体连接,构建得到全长cDNA克隆.鹅源副黏病毒NA-1株全长cDNA克隆成功构建,为下一步病毒的拯救奠定坚实的基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

本试验旨在建立一种快速的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)经典株和变异株的鉴别诊断方法。根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)经典株与变异株Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别诊断PRRSV经典株和变异株的RT-PCR检测方法;该方法能从经典株与高致病性株PRRSV基因组中分别扩增出549和459 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性;该方法能分别检测出1 pg经典株和0.1 pg变异株RNA含量。建立的RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确、快速鉴别出PRRSV经典株与变异株,将为猪繁殖与呼吸综合征病毒的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的鉴别诊断方法。     

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。     

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础.     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒2b基因的克隆和原核表达

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株2b基因序列,设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从PRRSV中扩增出222 bp的片段,并克隆至pMD18-T,连接到pGEX-4T-1表达载体,将阳性重组质粒pGEX-4T-2b转化到BL21(DE3),对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,所得重组蛋白的分子质量大小为35 ku,与预期结果相同,且具有良好的免疫学活性。     

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

根据欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计E1和E6 2套PCR引物和TaqMan荧光探针,建立E1和E6荧光RT-PCR方法,用于检测PRRSV。反应条件优化后,用10倍倍比稀释的质粒DNA、cDNA进行PCR扩增以检测其灵敏度,同时对猪瘟(CSFV)、猪伪狂犬(PRV)等7种病毒进行特异性检测。结果显示,建立的E1和E6荧光RT-PCR可以检出欧洲型PRRSV,敏感性依次为616和216个拷贝的PRRSV重组质粒DNA,而CSFV等非PRRSV均为阴性。建立的E1、E6荧光RT-PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可作为检测欧洲型PRRSV的技术储备。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BD株的分离及GP4基因的克隆

从河北保定分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过两代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为BD株.根据GenBank公布的PRRSV JXA1株0RF4基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整ORF4基因,将扩增产物连接到pMD19-T 载体并转化克...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF3基因的克隆及变异分析

从河北唐山分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过4代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为TS株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF3基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整ORF3基因,将扩增产物连接到pMD19-T载体并转化克隆菌,将阳性重组质粒PMD-GP3进行序列测定与分析。应用DNA Star软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株的ORF3基因进行序列比较,并绘制系统进化树。这为研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础。