基因工程学课程三位一体实践教学体系的构建与实施

为适应现代社会对创新型人才的需求形势,基因工程学课程打破传统的教学模式,对课程结构进行疏理、整合和探索,加大了实践教学内容整合力度,构建"理论教学+课程实验+科研训练"三位一体实践教学体系。有利于学生理论联系实际,加强学生的实际操作能力、分析能力和综合能力的培养。既能让学生巩固提高和升华所学知识,又提高了分析问题和解决问题的能力,为今后其走向社会、开展业务工作打下良好的基础。     

基于Nc-5基因的新孢子虫病PCR诊断方法的建立

根据GenBank上登录的犬新孢子虫Nc-5基因序列(AF061249),利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物,以牛源犬新孢子虫吉林株DNA为模板建立了PCR诊断方法。结果显示:建立的PCR方法扩增片段大小为608 bp,克隆基因测得序列与美国株(AF061249)同源性为99%;该方法扩增不出弓形虫、牛瑟氏泰勒虫等基因片段;扩增样本DNA含量为26.5 fg,具有较好的特异性和敏感性;应用建立的PCR方法与环介导等温扩增(LAMP)进行比较,其阳性符合率达100%。说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、快速等优点,完全适用于新孢子虫病的诊断。     

牛附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立

为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果:建立的牛附红细胞体单管套式PCR检测方法扩增的片段大小为361 bp,与GenBank中相应序列同源性为98%,该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、新孢子虫、布氏杆菌及牛无乳链球菌等基因片段,检测出标准模板DNA的最小量为1.22 fgμ/L。通过对吉林省延边地区66份血液样本的临床检测显示,单管套式PCR检出率28.8%,高于常规PCR的21.2%和鲜血压片镜检的12.1%,具有准确、特异、敏感等优点,是检测牛附红细胞体的一种新型、可靠的诊断技术。     

延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因的克隆与序列分析

为了解延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因特性,试验提取延边黄牛流产胎牛脑组织中犬新孢子虫DNA,应用PCR技术扩增延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因,并将此基因克隆到pMD18-TSimple载体上,筛选获得重组质粒,然后转化到大肠杆菌感受态细胞中,对PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的菌株进行测序,用DNASIS序列分析软件将目的基因与已发表的核苷酸序列进行同源性比较分析。结果表明:克隆的基因片段长度为681 bp,编码226个氨基酸,与GenBank中发表的NcSAG1基因(AY113004)核苷酸序列同源性为99.7%。     

弓形虫ROP4基因的克隆及原核表达载体的构建

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种严重危害人类及家畜的机会性致病原虫,可侵犯除成熟红细胞以外的任何有核细胞,引起多种组织、器官病变和损害[1].近年来,国内外学者对弓形虫的研究已取得了一定进展.     

牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白基因的克隆与序列分析

从病牛血液中提取总RNA,根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫HSP70基因序列设计合成1对引物,通过RT—PCR技术扩增出牛瑟氏泰勒虫HSP70基因,并将该基因克隆到pMD18-TSimple载体上,经PCR鉴定和EcoR工、Sal工双酶切鉴定为阳性的重组质粒测定及分析结果表明,该片段长1966bp,编码620个氨基酸残基．同源性分析表明,该序列与牛瑟氏泰勒虫HSP70基因同源性为95．78％．     

牛新孢子虫NcSAG1基因工程亚单位疫苗的免疫试验

为了解新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果,本试验提取延边黄牛新孢子虫野毒株基因组DNA,用PCR技术扩增新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因,并在大肠杆菌中进行原核表达,将Western-blot鉴定具有免疫活性的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备NcSAG1基因工程亚单位疫苗,免疫BALB/c小鼠,应用间接ELISA方法测定体液免疫水平,应用流式细胞技术测定细胞免疫水平,以此评价疫苗对实验动物的免疫应答反应。结果显示,制备的NcSAG1基因工程亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠后,在三免后第3天时,检测抗体的OD450nm值达0.688;CD4+/CD8+值达3.650,均显著高于重组蛋白免疫组和PBS对照组,说明制备的基因工程亚单位疫苗能够提高实验动物的体液免疫和细胞免疫水平。本试验为牛新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。     

东北三省部分地区猪附红细胞体16S rRNA核苷酸序列比较分析

为了解东北三省猪附红细胞体基因的流行变异情况,本试验选取相对保守的16S rRNA核苷酸序列作为分析对象,采用酚仿抽提法提取吉林株、辽宁株和黑龙江株猪附红细胞体基因组DNA,用一对特异性引物扩增目的DNA,然后分别与pMD-18T载体连接并转化BL-21菌株,经重组质粒PCR鉴定后并测序,比较其核苷酸序列。从同源性分析结果可以看出,黑龙江株、辽宁株与广东株猪附红细胞体核苷酸同源性最高,均达到100%;吉林株与美国株猪附红细胞体的核苷酸同源性最高,为97%。系统进化分析结果显示,黑龙江株与辽宁株猪附红细胞体亲缘关系最近,而与吉林株猪附红细胞体较远。结果表明,吉林株、辽宁株和黑龙江株猪附红细胞体16S rRNA基因序列存在差异。     

黑白花奶牛瑟氏泰勒虫病的诊治

珲春市北郊从四平地区购进的奶牛,在购入后一月左右,牛群出现食欲不振,精神下降,随后出现死亡。经临床检查,病理剖极及病源体检查,确诊为瑟氏泰勒虫病.用盐酸咪唑苯脲肌注治疗,并结合临床症状进行强心、补液、健胃、利尿,消炎等对症治疗,病牛在第4时基本康复.追访时血液涂片检查发现,牛红细胞染虫率下降到1%,同时表明了治愈牛有可能复发,应该高度重视.     

贝尼尔缓释剂的研制及对牛瑟氏泰勒虫病防治效果的研究

本试验首次用β-环糊精制备了贝尼尔缓释剂,并用于牛瑟氏泰勒虫病的防治上。首次制备兔抗贝尼尔血清,用免疫学方法检测贝尼尔在动物体内的消长情况.免疫学检测结果表明,该缓释剂的缓释效果比水剂组约延长1倍;本地牛按3mg·kg~(-1)体重剂量,外地牛按5mg·kg~(-1)体重剂量,进行肌肉注射,预防效果达100%.