牛新孢子虫NcSAG1基因工程亚单位疫苗的免疫试验

为了解新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果,本试验提取延边黄牛新孢子虫野毒株基因组DNA,用PCR技术扩增新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因,并在大肠杆菌中进行原核表达,将Western-blot鉴定具有免疫活性的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备NcSAG1基因工程亚单位疫苗,免疫BALB/c小鼠,应用间接ELISA方法测定体液免疫水平,应用流式细胞技术测定细胞免疫水平,以此评价疫苗对实验动物的免疫应答反应。结果显示,制备的NcSAG1基因工程亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠后,在三免后第3天时,检测抗体的OD450nm值达0.688;CD4+/CD8+值达3.650,均显著高于重组蛋白免疫组和PBS对照组,说明制备的基因工程亚单位疫苗能够提高实验动物的体液免疫和细胞免疫水平。本试验为牛新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。     

犬新孢子虫吉林株SAG1基因在BHK21细胞中的表达及免疫学评价

将构建成功的重组质粒pVAX-SAG1转染至BHK21细胞上,通过IFAT与RT-PCR方法检测重组质粒在BHK21细胞上的表达情况。大量提取重组质粒pVAX-SAG1,免疫Balb/c小鼠,分别在首免前、二免前、三免前以及三免后的第1、2、3周进行小鼠断尾采血,应用ELISA方法与流式细胞技术检测体液免疫水平和细胞免疫水平。结果表明,转染的重组质粒pVAX-SAG1在BHK21细胞中得到瞬时表达,并且重组质粒pVAX-SAG1免疫Balb/c小鼠后,在体液免疫水平上,pVAX-SAG1组与空载体pVAX1和PBS对照组差异极显著（P〈0.01）;在细胞免疫水平上,pVAX-SAG1组与PBS对照组差异显著（P〈0.05）。本试验为新孢子虫基因工程核酸疫苗的进一步研究奠定了基础。     

弓形虫GRA3基因真核表达质粒的构建与鉴定

以pGEX-GRA3为模板,经PCR扩增获得弓形虫GRA3基因,克隆于pMD-18T simple载体上。重组质粒经PCR鉴定、PstⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序分析,再将其定向插入真核表达载体pVAXⅠ,构建真核表达重组质粒pVAX-GRA3。经PCR和酶切鉴定后,将重组质粒pVAX-GRA3转染Hela细胞,然后进行RT-PCR检测。RT-PCR结果表明,检测到了目的基因的存在,说明pVAX-GRA3成功转入Hela细胞。     

貂源肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

2013~2016年山东省、河北省、黑龙江省、吉林省的部分水貂养殖场发生了严重的出血性肺炎,导致水貂大量死亡,为了客观评估水貂出血性肺炎的危害及为综合防控提供参考依据,试验对423个水貂病例样本进行分离鉴定并且对所分离的细菌进行了形态特征观察、16SrRNA基因测序、血清型鉴定、小鼠毒力试验测定、生化试验鉴定及药敏试验测定。结果表明:423个样本中分离到68株肺炎克雷伯氏菌,其中最为流行的血清型为K2型(35株);并筛选出4株菌株对小鼠有很强毒力性;生化试验结果表明同一血清型的不同菌株之间也存在明显差异;药敏试验结果表明,4株K2型肺炎克雷伯氏菌强毒菌株对氧氟沙星、阿米卡星2种抗生素均为敏感或介于中间;对强力霉素、环丙沙星等8种抗生素均耐药;对诺氟沙星、庆大霉素等4种抗生素均为耐药或介于中间。     

犬新孢子虫吉林株SAG1基因真核表达载体的构建

根据GenBank中已发表的犬新孢子虫SAG1基因序列(AF132217),设计了一对含有Kozak序列、起始密码子、终止密码子、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物。以含有SAG1基因的重组质粒pMD-18T-SAG1为模板,经PCR扩增获得SAG1基因,利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切该片段,回收含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点粘性末端的SAG1基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAX1真核表达载体中,获得重组质粒pVAX1-SAG1,经PCR鉴定、酶切分析和重组质粒的序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。     

牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因的克隆及分子分类学分析

为分析牛瑟氏泰勒虫延边株18SrRNA基因序列,根据GenBank上已发表的牛瑟氏泰勒虫18SrRNA基因序列设计2对特异性引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pMD18一T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,对测序结果用DNAMAN软件时其与GenBmlk上8个虫株相关序列进行同源性比较,建立系统发育树。结果显示,牛瑟氏泰勒虫中国延边株的18SrRNA基因大小为1744bp,瑟氏泰勒虫延边株、兰州株、日本株以及水牛泰勒虫中国株彼此之间亲缘关系最近;瑟氏泰勒虫延边株与突变泰勒虫亲缘关系较远：     

吉林株犬新孢子虫SAG1基因片段的克隆及蛋白抗原性预测

[目的]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆与序列分析。[方法]从细胞培养的吉林株虫体中提取犬新孢子虫DNA,根据已发表的犬新孢子虫鲥G1基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,采用PCR技术,扩增大新孢子虫SAG1基因片段,并成功克隆到pMD18-T simple载体上,对经PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列分析。[结果]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆后,获得阳性重组质粒。克隆的SAG1基因片段长780bp,编码260个氨基酸,与已发表的美国株犬新孢子虫SAG1基因核苷酸序列（AF132217）的同源性为99．0％,氨基酸序列同源性为98．8％。通过分子生物学软件对翻译水平进行预测,发现吉林株核苷酸序列并不影响氨基酸翻译与蛋白质的表达。[结论]该试验成功克隆重组质粒,为建立犬新孢子虫的高效表达系统奠定了基础。     

浒苔声反射特征的实验测定

以2008年夏季在中国黄海中南部海域引起绿藻暴发的主要种类浒苔(Enteromorpha prolifera)为研究对象,在消声水池内利用经过校正的、工作频率为70 kHz的Simrad EY500回声探测-积分系统对其声反射特征进行测定,根据浒苔的回声积分等测定值建立了浒苔声反射强度与浒苔密度关系的定量表达式.实验结果显示,浒苔是有效声散射体,其体积反向散射强度(Sv,dB)与浒苔密度(p,g/m3)之间的关系为Sv=17.31g p-95.9,与鱼类目标强度和体长关系具有类似的表述模式.结果证实渔业声学原理和现行渔业声学仪器、方法同样适用浒苔的探测,水声技术可成为下沉浒苔快速监测的有效手段.实验同时显示,浒苔的声散射特征具有其特殊的复杂性,这可能与其可通过光合作用产生气体(氧气)有关.因此,若欲利用声学方法对下沉浒苔资源进行定量评估调查,需对浒苔的生理生化特征进行同步观测研究.