基因工程学课程三位一体实践教学体系的构建与实施

为适应现代社会对创新型人才的需求形势,基因工程学课程打破传统的教学模式,对课程结构进行疏理、整合和探索,加大了实践教学内容整合力度,构建"理论教学+课程实验+科研训练"三位一体实践教学体系。有利于学生理论联系实际,加强学生的实际操作能力、分析能力和综合能力的培养。既能让学生巩固提高和升华所学知识,又提高了分析问题和解决问题的能力,为今后其走向社会、开展业务工作打下良好的基础。     

吉林省牛瑟氏泰勒虫病分子流行病学调查

为了解吉林省牛瑟氏泰勒虫病感染情况,本试验根据牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因序列设计引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法对吉林省珲春、通化、安图、舒兰、龙井、辽源、白山共7个县市采集的247份血液样本进行了牛瑟氏泰勒虫病分子流行病学调查,并进行不同地区、不同饲养方式、不同性别及不同年龄之间的比较。结果显示,牛瑟氏泰勒虫总体阳性率为39.68%(98/247),其中通化阳性率最高为70.00%(14/20),龙井阳性率最低为20.00%(8/40),地区之间除安图和白山差异不显著(P>0.05)外,其他各地区之间均差异显著(P<0.05);散养牛阳性率64.44%(58/90)与规模化养殖牛阳性率25.48%(40/157)之间差异极显著(P<0.01);母牛阳性率38.46%(50/130)与公牛阳性率41.03%(48/117)之间差异不显著(P>0.05);1岁以内牛阳性率为56.67%(34/60),1～3岁牛阳性率为42.22%(38/90),3岁以上牛阳性率为26.80%(26/97),不同年龄间差异显著(P<0.05)。结果表明,吉林省牛瑟...     

基于Nc-5基因的新孢子虫病PCR诊断方法的建立

根据GenBank上登录的犬新孢子虫Nc-5基因序列(AF061249),利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物,以牛源犬新孢子虫吉林株DNA为模板建立了PCR诊断方法。结果显示:建立的PCR方法扩增片段大小为608 bp,克隆基因测得序列与美国株(AF061249)同源性为99%;该方法扩增不出弓形虫、牛瑟氏泰勒虫等基因片段;扩增样本DNA含量为26.5 fg,具有较好的特异性和敏感性;应用建立的PCR方法与环介导等温扩增(LAMP)进行比较,其阳性符合率达100%。说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、快速等优点,完全适用于新孢子虫病的诊断。     

牛附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立

为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果:建立的牛附红细胞体单管套式PCR检测方法扩增的片段大小为361 bp,与GenBank中相应序列同源性为98%,该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、新孢子虫、布氏杆菌及牛无乳链球菌等基因片段,检测出标准模板DNA的最小量为1.22 fgμ/L。通过对吉林省延边地区66份血液样本的临床检测显示,单管套式PCR检出率28.8%,高于常规PCR的21.2%和鲜血压片镜检的12.1%,具有准确、特异、敏感等优点,是检测牛附红细胞体的一种新型、可靠的诊断技术。     

吉林省西部地区牛新孢子虫病流行病学调查

为了解吉林省西部地区牛新孢子虫病的流行情况,应用ELISA试剂盒对采自吉林省西部地区洮南市、洮北区、通榆县、宁江区和乾安县等5个县市区共计208份牛血清样本进行了牛新孢子虫病抗体检测,并对不同地区、不同饲养方式、不同类别、不同性别及不同年龄段的208份牛血清样本进行了统计学分析。结果表明:不同地区之间通榆县与洮北区牛新孢子病抗体阳性率差异显著(P0.05),而其他地区之间差异不显著(P0.05);放养牛和圈养牛之间牛新孢子病抗体阳性率差异显著(P0.05);黄牛和肉牛之间牛新孢子病抗体阳性率差异不显著(P0.05);公牛与母牛之间牛新孢子病抗体阳性率差异不显著(P0.05);1~3岁牛和4~6岁牛之间牛新孢子病抗体阳性率差异显著(P0.05)。试验证实,吉林省西部地区也是牛新孢子病的流行地区,为吉林省西部地区牛新孢子病防控提供了科学的流行病学资料。     

延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因的克隆与序列分析

为了解延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因特性,试验提取延边黄牛流产胎牛脑组织中犬新孢子虫DNA,应用PCR技术扩增延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因,并将此基因克隆到pMD18-TSimple载体上,筛选获得重组质粒,然后转化到大肠杆菌感受态细胞中,对PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的菌株进行测序,用DNASIS序列分析软件将目的基因与已发表的核苷酸序列进行同源性比较分析。结果表明:克隆的基因片段长度为681 bp,编码226个氨基酸,与GenBank中发表的NcSAG1基因(AY113004)核苷酸序列同源性为99.7%。     

弓形虫ROP4基因的克隆及原核表达载体的构建

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种严重危害人类及家畜的机会性致病原虫,可侵犯除成熟红细胞以外的任何有核细胞,引起多种组织、器官病变和损害[1].近年来,国内外学者对弓形虫的研究已取得了一定进展.     

牛新孢子虫NcSAG1基因工程亚单位疫苗的免疫试验

为了解新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果,本试验提取延边黄牛新孢子虫野毒株基因组DNA,用PCR技术扩增新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因,并在大肠杆菌中进行原核表达,将Western-blot鉴定具有免疫活性的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备NcSAG1基因工程亚单位疫苗,免疫BALB/c小鼠,应用间接ELISA方法测定体液免疫水平,应用流式细胞技术测定细胞免疫水平,以此评价疫苗对实验动物的免疫应答反应。结果显示,制备的NcSAG1基因工程亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠后,在三免后第3天时,检测抗体的OD450nm值达0.688;CD4+/CD8+值达3.650,均显著高于重组蛋白免疫组和PBS对照组,说明制备的基因工程亚单位疫苗能够提高实验动物的体液免疫和细胞免疫水平。本试验为牛新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。     

马泰勒虫不同PCR检测方法的比较

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫PCR检测方法，用Bec-UF2、Equi-R；EMA-1F、EMA-1R两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的核蛋白体基因和表面蛋白基因进行了常规PCR方法检测，用EMA-5、EMA-6；EMA-7、EMA-8两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的表面蛋白基因进行了PCR和套式PCR方法检测。结果显示，以Bec-UF2、Equi-R为引物的PCR方法的阳性检出率为57．1％（32／56），以EMA-5、EMA-6；EMA-7、EMA-8为引物的套式PCR方法的阳性检出率为51．8％（29／56），以EMA-1F、EMA-1R为引物的PCR方法的阳性检出率为17．9％（10／56）。结果表明，以Bec-UF2、Equi-R为引物的常规PCR方法为检测马泰勒虫的最佳方法。