稳定表达山羊SLAM受体的BHK-21细胞系的建立及应用

信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因的新城疫病毒感染性克隆的构建及病毒拯救

应用反向遗传技术对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株感染性克隆PBRN-FL质粒进行操作,构建插入欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5基因的重组质粒LaSota-ORF5并进行病毒拯救及鉴定。依据GenBank所发表的欧洲型PRRSV LV株ORF5序列,设计引物扩增ORF5片段,通过PBRN-FL质粒上P和M基因间的PmeⅠ酶切位点插入目的片段,构建重组质粒LaSota-ORF5。采用磷酸钙转染法将重组质粒和PCI-NP、PCI-P、PCI-L等3种辅助质粒共转染BSR-T7/5/细胞拯救病毒并对其分别进行RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和Western blot(WB)试验鉴定。结果显示:拯救病毒的RT-PCR产物测序结果正确,IFA出现绿色荧光,WB试验条带大小符合预期,证明GP5蛋白有效表达。结果表明:成功构建并拯救得到重组病毒rLaSota-GP5,为制备表达PRRSV GP5蛋白的重组NDV疫苗奠定基础。     

表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

 【目的】重组新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒（very virulent infectious bursal disease virus，vvIBDV）及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术，救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2，分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡，免疫后21 d分别以vvIBDV Gx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV－VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120 h，脑内致病指数（ICPI）分别为0.4和0.36，静脉内致病指数（IVPI）均为0；接种后72～96 h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0 EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏，免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100％保护，对vvIBDV攻击免疫保护率达90％以上。 【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性，免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病－新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。     

传染性法氏囊新城疫病毒二联疫苗株接种后气管黏膜损伤研究

为了研究传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒（rlasota—vo2）二联疫苗株的免疫机制，用rlasota—vp2免疫2日龄SPF雏鸡，接种后分别在接种后的1，3，5，10，15，18d取气管，进行光镜、电镜观察，利用免疫组化染色方法检测病毒在气管内的分布；光镜观察发现，接种后第3d黏膜下层水肿，淋巴细胞、巨噬细胞浸润，黏膜上皮形成空泡状，表层有数层不成熟的细胞组成；接种后第10d，腺体腔闭塞。免疫组化染色（IHC）气管固有层细胞呈阳性反应，棕色颗粒出现在胞浆中。电镜观察发现接种rlasota—vp2后第3d纤毛细胞有脱纤毛现象。接种第3d杯状细胞破碎，黏液成分增多，黏膜下层的纤维裸露到表面；接种后第10d，可以看到纤毛细胞纤毛上有球形粒子，杯状细胞、基细胞大量增生；接种后第18d，纤毛细胞脱纤毛区域进一步增大。这说明气管黏膜的损伤是机体重要的防御机制和免疫机制的表现。     

马耳它布氏杆菌bp26基因缺失株的构建及鉴定

为了建立马耳他布氏杆菌M5-90株弱毒疫苗株与野生株的鉴别诊断,本研究以bp26基因作为重组靶位点,以M5-90为亲本,利用bp26基因ORF外侧序列作为同源序列,将卡那霉素抗性基因(Kan')整合到细菌基因组中,双交叉重组阳性菌株,经SDS-PAGE和western blot试验表明迁移率约为29 ku的BP26蛋白在亲本菌中表达并可被鼠抗BP26高免血清识别,而突变株M5-90-26反应结果为阴性,表明BP26蛋白在突变疫苗株M5-90-26中未表达.M5-90-26具备从血清学角度区分M5-90-26免疫与野生型布氏杆菌感染,对布氏杆菌病防制、监测及净化具有重要的意义.     

不同毒力马耳他种布鲁氏菌体内外诱导细胞凋亡的研究

为探究不同毒力马耳他种布鲁氏菌能否在体内外诱导凋亡以及诱导凋亡程度的差异,本研究将M28(强毒株)和M5-90(疫苗株)以MOI=100感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,利用激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测凋亡产物caspase3/7。结果显示:M5-90和M28在体外细胞水平均能够诱导RAW264.7细胞凋亡,且M5-90促进细胞凋亡能力高于M28。然后将M28和M5-90以1×10~6 cfu的剂量接种BALB/c小鼠,分别在接种后3 d、7 d和42 d迫杀小鼠,取小鼠脾脏组织制备切片,经HE染色后进行形态学观察,利用透射电镜观察并通过Tunel法检测细胞凋亡。结果显示M5-90和M28感染后均可诱导小鼠脾脏细胞凋亡,凋亡细胞主要为T淋巴细胞。本研究为布鲁氏菌诱导宿主细胞凋亡和布鲁氏菌致病机理研究奠定了基础。     

硒增强雏鸡对IBD抵抗力机制的细胞免疫研究

为了解硒对雏鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）抵抗大的影响及其细胞免疫机制，自１日龄起给雏鸡分别饲喂基础（含硒０．０８６ｍｇ／ｋｇ）、补硒０．３ｍｇ／ｋｇ和０．６ｍｇ／ｋｇ的不同日粮，于４９日龄采用微量全血培养￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定其中自然发生ＩＢＤ后第１０天和正常对照雏鸡的Ｔ淋巴细胞转化率，并计算ＩＢＤ鸡死亡率。结果，两补硒组ＩＢＤ雏鸡死亡率显著低于基础日粮组ＩＢＤ雏鸡（Ｐ＜０．０１）；ＩＢＤ明显抑制雏鸡Ｔ淋巴细胞转化率（Ｐ＜０．０５；Ｐ＜０．０１）；补硒的正常对照雏鸡和ＩＢＤ雏鸡Ｔ淋巴细胞转化率分别高于各自基础日粮雏鸡（Ｐ＜０．０５；Ｐ＜０．０１）。结果显示补硒可提高雏鸡细胞免疫功能，从而增强雏鸡对ＩＢＤ抵抗力，降低雏鸡死亡率。     

传染性支气管炎病毒中国地方分离株RFLP基因分型的研究

为初步确定我国不同地区流行的传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）的基因分型，对分离自国内８个不同地域疫区的ＩＢＶＱＤ、ＧＺ、ＺＺ、ＴＪ、ＤＬ、ＹＣ、ＪＳ１和ＪＳ２及参考株Ｍ４１、Ｈ５２和Ｔ的Ｓ１基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增ｃＤＮＡ进行ＨａｅⅢ的ＲＦＬＰ分析。结果，ＱＤ与ＭＤ４１、Ｈ５２同属Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｅ基因型，ＧＺ、ＺＺ、ＹＣ与Ｔ的基因型相同，ＤＬ、ＪＳ１和ＪＳ２则表现为各自独立的基因型，而ＴＪ则为ＤＬ和Ｔ２种基因型毒株的混合感染，表明我国的广大地域内存在着Ｍａｓｓ基因型、Ｔ基因型和可能的变异株ＩＢＶ的流行。     

传染性支气管炎病毒类M_(41)地方分离株S_1基因克隆及高变区序列分析

传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株ＱＤ经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出约１．７ｋｂＳ１糖蛋白基因ｃＤＮＡ，修饰后插入ｐＵＣ１８ＳｍａｌⅠ／ＥｃｏＲＩ位点构成质粒ｐＵＣＱＤＳ１。对克隆的Ｓ１基因５′端高变区序列测定显示，起始密码上游６０碱基和下游３８０碱基中与参考株Ｍ４１Ｓ１基因序列仅有１个碱基的差异，表明ＱＤ为一类Ｍ４１分离株。