多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。     

副溶血弧菌tlh基因缺失株的构建

副溶血弧菌(Ⅵbrio parahaemolyticuss,VP)是我国海水养殖鱼、虾、贝类的重要病原,其主要致病因子热不稳定性溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)的功能和致病性仍不十分清楚.本研究利用PCR技术从VP临床分离株的基因组DNA中扩增出tlh基因,利用同源重组技术,构建了副溶血弧...     

水产品中的副溶血弧菌和霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立

针对副溶血弧菌的tlh基因和霍乱弧菌的vcc基因,分别设计特异性引物与TaqMan探针,建立检测水产品中2种细菌的双重荧光定量PCR体系,并进行了特异性与敏感性试验。结果表明,在相同反应条件下,副溶血弧菌和霍乱弧菌得到了特异性扩增,而与其共存于水产品中的其他细菌均未见扩增。将不同比例的DNA混合后检测发现,2种荧光信号的收集不存在相互干扰。副溶血弧菌FJ14和霍乱弧菌H4的敏感性试验结果表明,该体系的最低DNA检测量分别为0.25 pg0、.32 pg,人工染菌样品的最低检测限分别为34 cfu/mL和153 cfu/mL。与传统检测方法相比,该双重荧光定量PCR方法检测水产品中的副溶血弧菌和霍乱弧菌快速准确,结果直观。     

建立PC-PCR法快速、半定量检测养殖环境和水产动物中的致病性副溶血弧菌

以tl为靶基因,将菌落PCR技术和平板菌落计数法相结合,建立致病性副溶血弧菌快速、半定量检测方法。PCR扩增的目的片段为673 bp,人工污染样品检测最低限固体样品为3.1×102cfu/g,液体样品为1.3×102cfu/mL,菌落PCR每反应体系的检测低限为90 cfu。对人工污染样品的检测结果显示,PC-PCR方法检测结果与常规检测结果一致,可用于养殖环境及水产品中细菌的动态监测。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

复合探针实时荧光PCR技术快速检测海产品中 副溶血性弧菌方法的建立

副溶血性弧菌是一种食源性致病菌,海产品和其制品海鲜酱油等最容易被副溶血性弧菌污染,而副溶血性弧菌寄生于鲜虾、海鲜酱油等复杂的食品基质中有时却很难被检测出。以快速检测食品中的副溶血性弧菌为目的,针对副溶血性弧菌的tlh基因,设计引物和复合探针,采用实时荧光PCR方法检测鲜虾和海鲜酱油中的副溶血性弧菌,得出以下结论,该方法检测副溶血性弧菌具有较强的特异性和灵敏度,当鲜虾(固体)中的样品菌含量为10~3cfu·g~(-1)或海鲜酱油中的样品菌含量为10~3cfu·m L~(-1)时,无需增菌培养,即可快速检出。增菌6~8 h即可检出鲜虾(固体)或海鲜酱油(液体)的1cfu的副溶血性弧菌。     

环介导等温扩增技术检测克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌

建立了环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法。以副溶血性弧菌tlh基因作为靶基因,设计特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并分别采用LAMP检测方法和国家标准方法(GB/T4789.7-2008)对克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌进行检测。结果表明,建立的LAMP方法最低检出限为1×101 cfu/mL;对6种细菌共8株菌进行LAMP法扩增,仅3株副溶血性弧菌得到阳性扩增。建立的LAMP检测方法与国家标准检测方法检测结果一致,准确度高。     

食品中克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)双重PCR检测方法研究

根据克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)16S rRNA基因以及局部大分子合成(MMS)操纵子特异序列设计2对引物,经反应体系和条件优化,建立了双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,Cronobacter spp.菌株PCR扩增均可见2条特异性条带,而其他菌株PCR扩增均为阴性。纯菌检测双重PCR的灵敏度为6.3×103 CFU.mL-1,而相对应单重PCR的灵敏度分别为6.3×101 CFU.mL-1和6.3×103 CFU.mL-1;人工污染的食品样品(奶粉、牛奶、鸡肉)在经过24 h增菌后,检测限均可达100 CFU.mL-1或100 CFU.g-1。在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)存在的条件下,双重PCR的检测限没有受到影响。表明本试验建立的双重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能克服食品样品基质及杂菌的干扰,可应用于食品中Cronobacter spp.的检测。     

利用PCR技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

[目的]对副溶血性弧菌的检测进行研究。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）,以标准菌株（单增李斯特菌、哈氏弧菌）作为阴性对照对3株副溶血性弧菌进行特异性扩增,扩增引物采用副溶血性弧菌如基因中的tlh-3和tlh-4,同时利用PCR对人工污染的白对虾中的副溶血性弧菌进行检出限测定。[结果]结果表明,通过PER扩增,副溶血性弧菌在约449bp处扩增出特异性条带,单增李斯特菌、哈氏弧菌均未出现任何条带,扩增片段表现出极好的特异性。菌液稀释到3．3×10^2cfu／ml时,将其污染到白对虾中作PCR仍可扩增出目的片断。[结论]该研究表明PER检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为副溶血性弧菌辅助检测方法。     

混合培养对副溶血性弧菌致病株和非致病株生长的影响

以9∶1和1∶1的比例对致病性副溶血性弧菌(ATCC 33847:tdh+/trh-/tlh+;ATCC 17802:tdh-/trh+/tlh+)和非致病性副溶血性弧菌(G2:tdh-/trh-/tlh+;G8:tdh-/trh-/tlh+)在TSB培养基和熟虾中分别进行了混合和37℃10 h的混合培养,通过菌落原位杂交技术和PCR技术检测致病性菌株在混合培养前后的比例。结果显示,在TSB和熟虾中,致病菌比例均出现了下降。在熟虾样品中致病菌株下降的比例更高,其中ATCC17802和G8在熟虾样品中以9∶1比例混合并混合培养10 h后,致病菌比例从90%降为0。表明混合培养对致病性副溶血性弧菌菌株生长产生不利的影响,是造成水产样品中副溶血性弧菌感染频发却很难分离到致病性菌株的原因之一。     

不同除草剂在直播冬油菜田的除草效果研究

[目的]验证不同除草剂的除草效果,为直播冬油菜田的杂草防除提供借鉴。[方法]使用不同剂量25%胺苯磺隆可湿性粉剂和10.8%高效氟吡甲禾灵乳油在直播冬油菜田间进行单用和混用除草试验。[结果]25%胺苯磺隆可湿性粉剂在冬油菜4～5叶期使用可以有效防除田间的阔叶杂草;25%胺苯磺隆可湿性粉剂18.0～22.5 g/hm2＋400 ml/hm2的10.8%高效氟吡甲禾灵乳油可以有效防除油菜田间的阔叶和禾本科杂草,总防效达90%以上,且可以比人工除草节省成本1 100元/hm2。[结论]25%胺苯磺隆与10.8%高效氟吡甲禾灵乳油混用可以更好地防除冬油菜田间杂草。     

城中村改造中的多元主体互动

"非农化"和"城市化"两大社会潮流推进了城中村的不断进展,然而,随之出现的各种复杂的城中村问题也使得对城中村的改造迫在眉睫.当前,政府、市场、村民自身是城中村改造的三大主体,他们之间的博弈构成了城中村改造冲突的主要内容.确立政府在城中村改造互动中的主体地位、发挥市场在城中村改造互动中的资源配置作用、培育村民在城中村改造互动中的全局观念,是多元主体在城中村改造互动中矛盾消除的3个主要措施.     

中国农户运行中的微观组织机制分析

以农户与村级合作经济组织、村民自治组织、乡村党政组织之间相互联系的原则、方式、机理为主线,从四个方面分析了中国农户运行中的微观组织机制。结果表明:(1)农户与现行村级组织之间联系的机理,同时受行政管理机制、村民自治机制、市场经济机制调节,这也是村级合作经济组织发育程度较低、服务功能较弱的根本原因。(2)新形势下村级党支部与村民委员会之间的行为存在差别,其根源在于农村经济体制方面;与此相对应,农户一直在计划经济与市场经济之间的体制性摩擦的微观环境中生存发展,因而农户自组织化程度难以提高。(3)村级组织的功能之所以错位,关键是村级组织和乡镇组织之间存在着组织人事和经济利益关系,而这种内在的关系环境又与农户的要求和利益之间存在差异。基于这些判断,建议政府采取以下措施:(1)通过乡村微观组织改革和加快农村合作经济组织培育等方式,建立能够独立表达农户自己愿望和要求的农民组织;(2)通过完善村民自治制度等方式,规范农户与村级党组织、村民自治组织之间的关系;(3)通过改革乡镇政府管理农户的经济体制,保障以农户为基本单元的民主化村民自治组织建设。     

荔枝胚性愈伤组织及其体胚发生过程中染色体数目的变化

荔枝胚性愈伤组织及其体胚发生过程中,各离体培养物染色体数目均出现广泛的变异.除正常的荔枝体细胞染色体数目2n=2x=30外,还出现大量染色体数目异常的细胞.植物生长调节剂、培养时间、外植体种类及基因型等对染色体数目变异有一定的影响.愈伤组织染色体数目变异虽然在一定程度上影响荔枝体胚的再生植株频率,但胚性愈伤组织仍能分化形成大量的胚状体.     

民国时期新疆玛纳斯河流域的农业生产

玛纳斯河流域地处新疆天山北麓中段,位于新疆天山北坡综合经济带的中心地段,是新疆农业发展的核心地带之一。玛纳斯河流域真正意义上的农业开发始于清朝乾隆中期统一新疆之后。民国时期,玛纳斯河流域作为新疆战略要地,成为历次战乱的争夺焦点之一。流域屯垦和农业开发也经历了多次起伏,在水利建设和农牧业生产方面得到一定的发展,为新中国成立以来的玛纳斯河流域社会经济的发展奠定了重要基础。     

我国体育翻译人才培养中相关认识误区的探讨

通过对几个相似概念与体育翻译人才需求再审视的探讨,认为体育外语人才、体育英语人才、体育 翻译人才概念不能互相替代,侧重点不同;体育外语隶属于外国语言文学学科而非体育学学科;临场翻译 、体育训练翻译及体育赛事报道翻译等三种体育翻译人才的需求稳定且需求量会越来越大,且来源多种多 样,尚无系统供应源头,属于紧缺的体育翻译人才。建议在翻译学科下对体育翻译人才进行系统培养。     

瑞金市塘背岗脐橙合作社"猪-沼-果"生态模式失衡浅析

针对瑞金市脐橙合作社的果农们放弃原有的"猪-沼-果"复种模式,开始大量使用有机、无机化肥等问题进行了调查和探讨.并结合当地实际提出建议,以解决生态模式失衡问题,使果园走向绿色化可持续发展.     

世界燃料乙醇产业发展的若干技术问题探讨

乙醇作为发动机燃料由来已久,但直到近两年燃料乙醇产业才得以在全球迅猛发展,并对世界农产品市场格局和食物安全产生较大影响。产业崛起,科技先行。本文分析了世界范围内燃料乙醇产业发展的最新技术动态,指出了中国存在的主要差距和急需攻克的重点技术领域,这将有力推动国内燃料乙醇生产的规模化、产业化发展。     

铁矸石山生态修复初期土壤主要特征分析

研究了鞍山地区铁矸石山生态修复初期土壤主要特征及其变化规律。结果表明:与裸露矸石山相比,经生态修复的矸石山土壤物理性质和化学性质均有不同程度的改善。经过生态修复的铁矸石山土壤容重和非毛管孔隙度减小、毛管孔隙度增大,土壤持水能力提高,同一时期土壤水分垂直变化规律基本一致,自上而下呈减少趋势,且阴坡>阳坡>裸露矸石山;土壤有机质、氮、磷、钾含量,相比裸露矸石山均有所提高,且阴坡好于阳坡好于裸露矸石山,阴坡和裸露矸石呈中性,阳坡矸石略呈酸性。     

中国社会转型期农村家庭养老存在的问题与对策

随着社会的转型,城市化、工业化和现代化进程的加快,农村家庭养老问题日益突出。从4个方面分析了当前和今后一段时间内农村家庭养老的严峻性和存在的问题,并提出了相应的解决方案。首先,要大力发展农村经济,增加农民收入,夯实农村家庭养老的社会经济基础;其次,与社会养老相结合,逐步完善农村社会养老保险制度;第三,加强养老立法,规范家庭养老;最后,大力宣传尊老、养老、敬老之风,弘扬"孝悌"观念。