基于NHS基团修饰的副溶血性弧菌免疫磁珠制备及其富集性能评价

[目的]制备NHS基团修饰的副溶血弧菌免疫磁珠并评价其富集性能。[方法]采用偶联率确定免疫磁珠最佳制备条件(磁珠粒径、偶联时间和抗体加入量),采用捕捉率确定免疫磁珠最佳富集条件(菌悬液p H、孵育时间和免疫磁珠加入量),并通过方法的特异性、灵敏度、精密度和稳定性评价免疫磁珠富集性能。[结果]0.1 m L N2型NHS磁珠可与0.2 m L副溶血弧菌抗血清偶联2 h制备IMB_(VP),加入到副溶血弧菌菌悬液(p H 7.0~7.4)中孵育2 h,IMB_(VP)最佳工作液体积为0.4 m L。该方法特异性好、灵敏度高(15 cfu/50 m L)、精密度高(批内变异系数和批间变异系数均在3%~6%)、稳定性好(准确度大于91%)。[结论]自制副溶血弧菌免疫磁珠富集性能好,方法工作效率高,成本低,为副溶血弧菌高效快速检测提供了可靠的富集手段。     

虾源副溶血弧菌致病基因检测与ERIC-PCR分型

为了监测上海市养殖对虾中副溶血弧菌致病基因的携带情况及潜在致病株流行情况,采用PCR方法对上海地区不同对虾养殖单位中分离获得的19株副溶血弧菌分离株及1株标准菌株进行6种致病基因的检测筛查,并采用ERIC-PCR方法进行基因分型分析。结果发现:19株副溶血弧菌中未检测出携带tdh、ORF8基因,只有1株携带trh基因,而tox RS/new基因携带率较高,19株中有14株检出阳性,基因携带率为73.7%。对能够引起对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的副溶血弧菌特异性质粒基因的检测中发现,AP1和AP2基因均有3株检测出阳性,基因携带率均为15.8%。通过ERIC-PCR分型技术将20株副溶血弧菌分成7个不同的类群,其分辨力指数DI值为0.811,表明ERIC-PCR具有较好的基因分型能力,分型结果发现该方法能够有效区分不同时间段获得的菌株,而对不同地理位置获得的菌株区分并不明显。以上结果表明从养殖对虾中分离得到的副溶血弧菌致病基因携带率总体偏低,但存在一定的流行风险,需要防范一些新的致病株的流行,这些可以为对虾养殖单位中副溶血弧菌致病流行株的预防控制提供相关参考。     

副溶血弧菌VP-5的分离鉴定及其与鲈鱼免疫信号通路相互关系研究

为探讨福建省漳州市盛明养殖场鲈鱼的致病菌及其与鲈鱼免疫信号通路的相互关系,从而可以预防和治疗该疾病。解剖患病鲈鱼肝脏组织后划线培养分离纯化了致病菌VP-5。显微镜观察该致病菌VP-5形态为球杆状,弧形,有单鞭毛,运动活跃,革兰阴性菌。在VITEK-32全自动微生物分析仪鉴定后,该致病菌对酪氨酸、葡萄糖、甘露醇等反应阳性,对蔗糖,阿拉伯糖和棉子糖等反应阴性。分析了该致病菌16SrRNA和tdh1基因序列,发现其与副溶血弧菌的亲缘关系非常接近。综合后鉴定致病菌VP-5为副溶血弧菌。并研究了副溶血弧菌VP-5侵染鲈鱼后寄主免疫信号通路基因cd63/cxcr4/il-8的表达水平差异。鲈鱼腹腔注射感染副溶血弧菌VP-5,感染后0-96h解剖鲈鱼肝脏组织和表皮组织。采用Trizol试剂盒抽提鲈鱼总RNA,反转录后生成cDNA。利用实时荧光定量PCR技术对鲈鱼免疫信号通路基因cd63/cxcr4/il-8表达水平进行测定。鲈鱼受到副溶血弧菌VP-5感染后,免疫信号通路基因cd63/cxcr4/il-8在鲈鱼肝脏组织的表达量12h和24h时与对照组相比较差异显著(P<0.05)；在表皮组织的表达量在24h和36h时与对照组相比较差异显著(P<0.05)。证实鲈鱼肝脏组织免疫信号通路基因的表达与副溶血弧菌VP-5的感染正相关,相对于表皮组织反应更快。因此鲈鱼的免疫信号通路基因cd63/cxcr4/il-8积极反应于致病菌,这些基因的快速表达会引发鲈鱼自身免疫应答,增强其抵抗致病菌的能力。     

共存体系中对虾优势腐败菌对副溶血弧菌生物被膜形成的影响

【目的】评估对虾优势腐败菌对副溶血弧菌生物被膜形成的影响,为对虾生产中生物被膜的危害评估和控制提供理论支持。【方法】采用改良微孔板法,分别检测5种腐败菌羽状变形杆菌(Proteus penneri)camtE、camtG、camtJ,希瓦氏菌(Advenellasp)camtF和未命名菌(Unknown)camtB的胞体或其乙酸乙酯提取物,与3株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)ATCC33847、ATCC17802和CAMT13011共培养后生物被膜的形成量,并用光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜的形成情况。【结果】羽状变形杆菌camtE、camtG、camtJ及希瓦氏菌camtF和未命名菌camtB的乙酸乙酯提取物对副溶血弧菌ATCC33847、ATCC17802、CAMT13011生物被膜形成的促进作用大于上述5种腐败菌胞体的促进作用,前者生物被膜洗脱液OD600相对值达到0.46~0.83,后者仅达到0.26~0.59。副溶血弧菌与5种腐败菌乙酸乙酯提取物共培养48h后其生物被膜形成受到促进,洗脱液OD600相对值为0.47~0.84;其中羽状变形杆菌camtE、camtG和camtJ乙酸乙酯提取物对3株副溶血弧菌的促进作用最明显,其生物被膜洗脱液OD600均值分别为0.74,0.70和0.68。【结论】5株对虾优势腐败菌与副溶血弧菌共培养可使原本产膜能力较弱的副溶血弧菌形成较致密的生物被膜,而这种影响可能与菌群间的群体感应信号分子有关。     

烟台海域鲜活海产品副溶血弧菌的污染概况及致病风险评价

为了掌握烟台海域鲜活海产品副溶血弧菌(简称VP)污染值概率分布,评估其膳食致病风险,依据GB 4789.7-2013规定方法,对分层随机采集的烟台海域7类420种鲜活海产品进行VP检测,并借助@Risk软件进行数值拟合.结果表明,烟台海域鲜活海产品VP总体污染率为23.33%,双壳类最高为26.28%,其次是头足类(25.00%)、棘皮类(25.00%)、鱼类(23.29%)、甲壳类(23.21%)、腹足类(18.75%)、海藻类(16.00%).腹足类污染值概率分布为贝塔分布、海藻类、棘皮类和双壳类指数分布,甲壳类极值分布、头足类三角分布、鱼类伽玛分布.黄、渤海海域海产品中VP总体污染率持平,VP污染值均为指数分布.第三季度水产品中VP污染率最高,各季度间比较,差异具有统计学意义(χ2=17.34,P=0.000171),第二、三、四季度VP分布分别为贝塔分布、极值分布和指数分布.鱼类的VP膳食致病风险概率值最高为1.97×10-4,其次为双壳类>头足类>甲壳类>棘皮类>腹足类>海藻类,全年的VP致病人次数均值为5.04×10-4次/人·年.说明烟台海域鲜活水产品普遍存在VP的污染,具有一定的膳食致病风险.     

凡纳滨对虾Crustin-like基因的克隆及在副溶血弧菌感染条件下的表达分析

【目的】研究凡纳滨对虾Crustin-like基因(即CL基因)的结构和功能,探明CL基因是否参与副溶血弧菌侵染条件下的免疫应答,为进一步研究凡纳滨对虾的免疫机制和抗病育种奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆凡纳滨对虾CL基因;用DNAstar、Clustalx、MEGA 5.0、PROSITE、TMpred和SignalP软件,分析CL基因序列及其蛋白结构,并预测蛋白功能;利用副溶血弧菌进行攻毒试验和实时定量PCR,检测CL基因在病原侵染条件下的表达情况。【结果】克隆获得了凡纳滨对虾CL基因(登录号:JQ824114)的cDNA,全长为501bp,含有33bp的5′非翻译区(1～33bp)和24bp的3′非翻译区(478～501bp),编码区为444bp,共编码147个氨基酸;对CL蛋白结构及功能的分析表明,该蛋白编码蛋白质含有1个信号肽、1个跨膜螺旋和1个WAP结构域;攻毒试验表明,副溶血弧菌刺激可导致CL基因表达量的明显变化,总体呈现出先降低后升高的变化趋势。【结论】克隆了凡纳滨对虾CL基因的全长,发现其与副溶血弧菌侵入后引发的免疫反应密切相关,可以作为副溶血弧菌感染前期诊断的参考指标。     

斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。     

两种弧菌感染大黄鱼免疫相关基因的SNP位点分析

为了探究大黄鱼(Larimichthys crocea)免疫相关基因的SNP与弧菌抗性关系,分别利用鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)人工感染大黄鱼。对感染前后抗感群体的转录组进行高通量测序、筛选并分析其抗病差异:(1)筛选氨基酸的非同义突变SNP位点在抗鳗弧菌组有17个,而抗副溶血弧菌组的有28个;(2)一代测序验证结果发现,染色体NW_011323507.1上白细胞介素6受体基因(IL-6R)第91 196位碱基G突变为C,导致缬氨酸突变为亮氨酸,该位点G/C在抗鳗弧菌组、对照组样本之间突变基因型CC频率分别为12.5%和0,呈显著性差异(P0.05);(3)补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9(CTRP9)基因在染色体NW_011323975.1上的35 665位碱基突变(A-G),在副溶血弧菌抗感易感群体中突变位点基因型GG频率分别为37.5%和0,呈极显著性差异(P0.01)。结果表明,IL-6R-91196-G/C位点突变与大黄鱼抗鳗弧菌有关联,CTRP9-35665-A/G位点突变与大黄鱼抗副溶血弧菌有关联,这为大黄鱼抗弧菌群体的选育提供了理论依据。     

副溶血弧菌中具有Mg~(2+)转运功能的MgtE基因的分子克隆与功能鉴定

MgtE基因家族是最初在细菌中发现的一类具有Mg2+转运能力的基因家族。基因组数据库搜索显示副溶血弧菌(Vibrio parahaaemolyticus RIMD 2210633,VP)中存在一个MgtE基因家族成员。克隆了该基因并将之命名为VP-MgtE,并利用沙门氏杆菌突变株MM281作为宿主菌进行了功能互补实验,同时运用定点突变的方法研究了VP-MgtE中的保守氨基酸对其功能的影响。     

PCR衍生技术快速检测副溶血弧菌的研究进展

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引发食物中毒的重要病原菌,因此,快速、准确地对食品中副溶血弧菌进行检测是预防该菌引起食物中毒的关键。综述了近年来国内外利用PCR衍生技术快速检测该菌的研究进展,为该菌检测方法的应用与开发提供一定的参考和理论依据。     

C型口蹄疫病毒VPI基因的克隆及真核表达载体的构建

应用PT-PCR扩增C型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因,将其克隆到pMD18-T载体中,并对克隆载体和VP1基因进行序列分析。将VP1基因和选择标记基因——二氢叶酸还原酶（dhfr）基因插入真核表达载体pCI-neo中,对所构建的重组真核表达载体进行PCR扩增、酶切鉴定和序列分析。结果表明,VP1基因与GenBank中标准毒株（登录号EU553893）VP1的序列同源性为92.8%,VP1基因的真核表达载体pCI-VP1-D构建成功。     

传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆、序列分析及原核表达鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。根据GenBank已登录的IB-DV VP2基因序列,设计合成一对VP2基因特异性引物,应用RT-PCR技术从陕西省某鸡场分离的IBDV毒株中克隆VP2基因并进行序列分析。再将VP2基因亚克隆于原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-VP2,经鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE检测。成功克隆IBDVYL毒株VP2全基因序列,核苷酸和氨基酸序列分析表明,YL株为IBDV超强毒株。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,在宿主菌BL21中成功表达约为53 ku的VP2蛋白。IBDV VP2基因克隆表达成功,为IBDV的分子生物学特性研究提供资料,其表达产物为进一步制备抗IBDV单克隆抗体奠定了基础。     

MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析

血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的UL49h基因编码病毒被膜蛋白VP22在病毒的复制和传播过程中具有非常重要的作用.根据已发表的MDV-1 GA株的序列,从CVI988/Rispens弱毒株感染的鸭胚成纤维细胞中扩增VP22基因片段,结果获得大小为732 bp的PCR产物.将PCR产物克隆T载体并测序分析,结果发现,与经典强毒GA株相比,弱毒株CVI988的VP22存在3个定点突变和一个缺失性突变.缺失的位点亲水性强,并位于VP22主要的抗原决定簇区.结果证明强毒株与弱毒株的VP22存在明显差异,为利用CVI988 VP22的蛋白传导域传导目的蛋白奠定了理论基础.     

口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体的构建及VP1基因稳定表达细胞系的建立

【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好．     

犬细小病毒HL-01株的分离鉴定及VP2基因真核表达质粒的构建

从临床发病犬采集粪便样品,以F81传代细胞进行病毒分离,经血球凝集实验(HA)和血球凝集抑制实验(HI)初步鉴定为犬细小病毒。为进一步确诊,根据Genbank中已发表的犬细小病毒VP2基因序列设计并合成一对引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出CPV VP2基因,酶切,测序加以鉴定。其序列与国际已发表的CPV-d(type 2)、CPV-1(5 type 2a)、CPV-3(9 type 2b)VP2序列同源性分别为98.97%,98.75%,98.69%,氨基酸序列的同源性分别为98.12%,97.60%,97.60%,从而证明此分离株为犬细小病毒。在获得VP2基因的基础上,为实现VP2蛋白的表达,构建了真核表达质粒pMel BacC-VP2。     

牛轮状病毒VP4基因与LTB基因的融合表达及免疫原性研究

PCR扩增轮状病毒VP4基因和大肠杆菌LTB基因编码区,将其克隆至pET32a载体上,构建pET32a-VP4-LTB质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),PCR、酶切鉴定后进一步测序,测序结果表明融合基因片段由2637 bp组成,为编码879个氨基酸残基的多肽。经IPTG诱导和SDS-PAGE检测发现表达产物分子量约为118.9 KD,以包涵体的形式存在。融合蛋白经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化后免疫小鼠,结果所产生的抗体效价高于单独VP4蛋白的免疫结果但差异不显著(P0.5),但与对照组相比差异显著。表明所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性,为研制牛轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP1基因在胡萝卜中的表达

为了生产一种可以直接口服的口蹄疫疫苗,以胡萝卜(Daucus carota L.var.sativa)无菌幼苗下胚轴诱导的愈伤组织为受体材料,通过农杆菌LBA4404介导的遗传转化,在CaMV双35S启动子的驱动下,将口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1基因的活性肽片段(包括2个141~160位肽和1个200~213位肽的基因片段)导入胡萝卜愈伤组织细胞。经PCR和PCR-Southern杂交等方法鉴定转化苗,确认口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因已整合到胡萝卜染色体中,转化效率达到52%。SDS-PAGE试验结果初步证明,在转化苗总蛋白中有目的基因表达,胡萝卜种子中可溶性蛋白含量最高,达3.57 g/L,而根中可溶性蛋白含量最低,仅有0.17 g/L;靠近心叶的叶片可溶性蛋白含量可达到1.475 g/L,而最外部叶片可溶性蛋白含量仅有0.37 g/L,相差近5倍。Dot-ELISA和ELISA检测结果表明,转化苗中表达的口蹄疫病毒结构蛋白VP1可以与FMDV灭活疫苗免疫动物制备的抗体特异结合。以上试验结果证明,口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因在转基因胡萝卜中表达成功。     

兔出血症病毒YL株衣壳蛋白VP60基因在原核系统中的高效表达

为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),VP60基因与中国RHDV最早期分离株WX84的VP60基因核苷酸序列同源性为93.0%,氨基酸序列同源性为95.8%。构建成功YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。1 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,VP60融合蛋白分子质量约为75 ku,其表达量占总菌体蛋白的39.8%。Western blot检测结果表明,VP60融合蛋白可以和RHDV抗血清发生特异反应。本研究结果显示,兔出血症病毒在干旱半干旱条件下的遗传变异和免疫学特征无较大变化。     

猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因共表达对PPV病毒样颗粒形成的影响

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,得到了重组质粒pPI-2.EG-FP.VP2。再以含有PCV2 SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因,进一步将其插入pPI-2.EGFP.VP2中,构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的真核表达载体pPI-2.EG-FP.VP2.ORF2。用脂质体介导法将pPI-2.EGFP.VP2.ORF2 DNA转染Vero细胞,观察绿色荧光蛋白的融合表达,采用ELISA方法检测转染液与PPV、PCV2高免血清的反应特性,同时将转染出现绿色荧光明显的Vero细胞制备电镜样品。结果显示,VP2基因、ORF2基因与绿色荧光蛋白得到融合表达,转染液与PPV、PCV2高免血清具有良好的抗原抗体反应特性,电镜观察到重组病毒样颗粒的形成。