斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。     

斑马鱼报警反应产生发育阶段的研究

鱼类在遭受捕食后,受损的表皮会释放大量的化学信号物质,同种其它个体嗅到这些化学信号后会作出躲避反应,称为报警反应(alarm response),报警反应通常出现在一定的发育阶段。采用斑马鱼(Dinio rerio)同种碾碎提取物(处理组,质量浓度为10-6g·L-1)作为报警物质,并设3个对照组:罗非鱼碾碎提取物组、双蒸水组、空白对照组,通过暴露处理实验,检测沉底累积时间(time of bottom)、呆滞累积时间(time of freezing)两项指标,研究了28 dpf(days post fertilization,受精后天数)、35 dpf、42 dpf 3个不同发育时期幼鱼的报警反应。结果显示:28 dpf时,处理组与3个对照组相比,在沉底累积时间、呆滞累积时间两项指标上均无显著差异,这个时期处理组有2 ind斑马鱼出现"沉底",其中1 ind出现"呆滞";35 dpf时,处理组与3个对照组相比,在沉底累积时间上有显著差异(P0.05),在呆滞累积时间上无显著差异,这个时期有5 ind斑马鱼出现"沉底",其中1 ind出现"呆滞";42 dpf时,处理组与对照组相比,在沉底累积时间、呆滞累积时间两项指标均有显著差异(P0.05),这个时期有8 ind斑马鱼出现"沉底",且8 ind全部出现"呆滞",与此对应的是这个时期大部分个体出现明显的报警反应。研究表明,斑马鱼报警反应产生的发育阶段为35~42 dfp之间,结合已知的野外斑马鱼生活史,推测斑马鱼在特定的阶段产生报警反应可能与栖息地的迁移有关。     

利用CRISPR/Cas9构建斑马鱼tbx20基因突变体及其功能分析

转录因子TBX20在脊椎动物心脏的腔室发育和维护中起至关重要的作用。利用CRISPR/Cas9系统成功制备了斑马鱼tbx20突变鱼系,T7E1检测结果显示F_0敲除效率平均为42. 1%,测序分析F_1中突变种质遗传效率为36. 7%。F_2突变体中观察到心脏突变表型:48 hpf,心包腔肿大,静脉窦瘀血,环化异常,心脏结构变形; 3 dpf,心脏畸形拉伸成线状结构。原位杂交和qRT-PCR结果显示,突变体中vmhc表达上调,amhc和myl7表达下调。成功制备了斑马鱼tbx20突变体,结果表明tbx20纯合突变体心脏畸形,环化受到影响,为深入探究tbx20在早期心脏腔室分化过程中的作用奠定了基础。     

斑马鱼hoxb4a在心脏发育中的功能

斑马鱼转录因子hoxb4a在心脏中的功能未见研究报道,为了阐明hoxb4a在心脏发育中的作用,本文利用基因沉默技术和mRNA基因过表达方法,分别在斑马鱼中敲降和过表达hoxb4a基因,发现抑制或过表达hoxb4a的胚胎在第3天出现心包腔肿大、心脏环化异常的表型。通过原位杂交技术对野生型及hoxb4a敲降胚胎进行心肌特异基因的原位杂交染色比较,测量结果显示hoxb4a敲降胚胎的心脏环化角度增大（P<0.01）。接着利用转基因鱼系,发现敲降hoxb4a后的胚胎存在鳃弓异常、心内膜畸形的表型。进一步使用qPCR检测hoxb4a沉默后心脏相关基因的表达量变化, 结果显示 hoxb4a敲降后,多数心脏发育关键基因出现显著性下调,而调控心脏腔室分化的关键基因nppa明显上调（P<0.05）。本研究表明斑马鱼hoxb4a沉默会导致心脏结构畸形、环化异常,并且调控了早期心脏发育基因的变化。本研究发现了hoxb4a在斑马鱼早期心脏发育中发挥作用,并通过原位杂交及qPCR结果初步探索了hoxb4a调控心脏腔室的分化及心脏环化过程,深化了人们对心脏发育调控网络的认识。     

糖原贮积症Ⅴ型斑马鱼疾病模型的构建及其表型分析

建立肌型糖原磷酸化酶基因pygma和pygmb突变体斑马鱼疾病模型,对人类PYGM基因突变导致的糖原贮积症Ⅴ型(glycogen storage disease typeⅤ,GSDⅤ)的研究具有重要意义。利用CRISPR/Cas9技术成功敲除了斑马鱼pygma和pygmb基因,分别获得pygma^(-11bp-/-)和pygma^(+14bp-/-)两种纯合突变体,以及pygmb^(+1bp-/-)和pygmb^(-2bp-/-)两种纯合突变体。过碘酸希夫糖原染色(periodic acid Schiff stain)实验显示pygma^-/-和pygmb^-/-纯合突变体心脏和肌肉组织出现明显的糖原累积。对野生型斑马鱼15个早期发育时间点以及12个成鱼组织中pygma和pygmb基因表达分析显示,pygma和pygmb早期发育阶段表达模式相似,从24 hpf到125 hpf,两基因表达量总体呈上升趋势,且pygmb的上升幅度大于pygma的上升幅度。在检测的12个组织中,pygma和pygmb只在少数几个组织中有明显表达。pygma在肌肉组织中表达最高,其次为心脏和皮肤组织;pygmb在心脏、脑、眼睛3个组织中高表达,在肌肉组织中也有表达,但表达量相对较低。斑马鱼pygma^-/-和pygmb^-/-突变体具有GSDⅤ病肌肉糖原累积的典型特征,该疾病模型的建立为进一步研究糖原贮积症的发病进程、详细机制和药物筛选等治疗策略提供基础数据。