产气荚膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

为研究产气荚膜梭菌α、β、ε3种主要外毒素的免疫原性,构建基因亚单位多价疫苗,本研究通过PCR分别扩增α-β2及ε3种毒素基因,分别克隆于p Pro HTa载体中构建重组表达质粒p Pro-α-β2-ε,并转化大肠杆菌进行这3个目的基因的融合表达。SDS-PAGE分析显示,表达的α-β2-ε毒素融合蛋白大小约90 ku,主要以包涵体形式存在。将其免疫BALB/c小鼠后,分别利用A型和B型产气荚膜梭菌强毒素对免疫鼠进行攻毒,并测定免疫鼠血清中抗体对毒素的中和活性。结果表明,免疫鼠对A型和B型产气荚膜梭菌毒素1 LD100和2 LD100的攻毒保护率分别为100%和60%以及100%和80%。体外中和试验显示,免疫鼠血清稀释为1∶20时,对1 LD100A型和B型产气荚膜梭菌毒素的中和效率均可达到100%。以上结果表明,本研究制备的α-β2-ε融合蛋白具有良好的免疫原性,能够有效刺激机体产生中和抗体,可以作为基因工程疫苗的有效组分,为产气荚膜梭菌多价候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清抗体的间接ELISA方法,本研究以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原,优化ELISA反应条件,建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对PEDV血清检测为阳性,对猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒感染猪的阳性血清检测结果均为阴性;其批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。采用建立的ELISA方法检测了130份临床样品,其中78份血清样品为PEDV抗体阳性。表明建立的以重组N蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可以用于检测PEDV感染及相关的流行病学调查。     

表达F4~+ETEC的靶向性乳酸杆菌活菌载体的构建

为了研究M细胞靶向肽(Co1)和树突状细胞靶向肽(DC-targeting peptide,DCpep)的免疫增强作用,用实验室构建的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88ac-STa-LTB-STb-co1(KSLS-co1)的阳性质粒为模板,通过PCR的方法获得DCpep-KSLS-co1和KSLS-co1-DCpep融合基因。然后将DCpep-KSLS-co1、KSLS-co1-DCpep基因亚克隆到p PG612.1表达载体中,转化到干酪乳酸杆菌L.casei393。Western blot和间接免疫荧光分析显示,DCpep-KSLS-co1、KSLS-co1-DCpep基因在干酪乳酸杆菌中获得了表达。本试验为进一步研究M细胞靶向和树突状细胞靶向策略在乳酸菌活载体疫苗系统中应用提供物质基础。     

表达猪乳铁蛋白肽重组屎肠球菌对断奶仔猪生长性能的影响及其抗ETEC感染效果研究

本试验以表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌（pNZ8112-PLFcin/Ef）饲喂断奶仔猪，研究其对仔猪生长性能的影响和抗产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）感染的效果。选取28日龄体重相近的健康断奶仔猪36头，随机分为3组（重组屎肠球菌组、空载体组和培养基组），每组3个重复，每个重复4头仔猪。重组屎肠球菌组和空载体组分别饲喂添加pNZ8112-PLFcin/Ef （6×10¹² CFU/kg）和pNZ8112/Ef （6×10¹² CFU/kg）的基础日粮，而培养基组饲喂含有相同体积的GM17液体培养基的基础日粮。试验期26 d。结果显示，与培养基组相比，重组屎肠球菌组断奶仔猪的平均日增重极显著提高（P<0.01）；料重比显著降低（P<0.05）；腹泻率明显降低，肠道菌群的均匀度和多样性指数均下降。为进一步探究表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌对断奶仔猪抵抗ETEC感染的保护作用，在连续饲喂21 d后，每个重复中随机挑选1头体况相近的断奶仔猪灌服ETEC。结果发现，与培养基组相比，攻菌后重组屎肠球菌组断奶仔猪血清白细胞介素-2（IL-2）、免疫球蛋白G （IgG）含量、肠黏液中分泌型免疫球蛋白A （sIgA）水平均显著升高（P<0.05）；脾脏指数显著提高（P<0.05），但胸腺指数、肠段长度及重量则均无显著差异（P>0.05）。综上所述，表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌能够起到促进断奶仔猪生长及抗ETEC感染的保护作用。     

肠道菌群抗病毒机制研究进展

近年来，由于对肠道中菌群的研究不断深化，同时对肠道菌群和机体健康的关系也有了更加清晰的认识，发现肠道菌群对病毒的感染有着双重调节的作用。肠道菌群可以通过保护肠黏膜屏障以及直接与病毒结合进而中和病毒或者阻止病毒对细胞黏附的直接作用抑制病毒感染，或通过对机体免疫系统建立和发育产生影响的间接方式来抑制病毒的入侵以及分泌具有抗病毒作用的代谢产物来发挥抗病毒作用；此外，益生菌在疾病治疗中的作用也越来越突出，有望从益生菌入手解决当前治疗病毒性疾病的弊端。本文着重对近年来肠道菌群抵抗病毒感染的相关机制研究进展进行综述，并对此方向相关问题及进一步的相关研究进行展望。     

重组犬IFN-γ在大肠杆菌中的高效表达

提取Concavadin A诱导培养的犬脾细胞总RNA，经RT-PCR扩增出犬IFN-γ，克隆到pMD18-T载体并测序鉴定，然后把IFN-γ基因克隆到原核表达载体PJLA605，构建pRL-Ca／IFN-γ表达质粒；应用M9培养基通过摇瓶发酵，确定诱导时机和诱导表达时间。结果表明，工程菌pRL-CaIFN-γ在30℃培养至OD600为1．5于42℃诱导4h，菌体收获量湿重达20．0gm，目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的32％，外源基因在该基因工程菌中得到了高效表达。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在大肠杆菌中的表达及其特性研究

将大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(LTB)基因eltb克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21/DE3/plyss。采用SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明,在大肠杆菌中高效表达了LTB蛋白,其产量约为细菌总蛋白的20%,GM1-ELISA方法鉴定目的重组蛋白可与GM1结合,具有潜在的佐剂活性;由纯化的重组蛋白免疫小鼠制备的抗血清效价为1:16000,并且可以特异性识别天然毒素。结果表明,所表达的LTB有良好的抗原性和佐剂活性,制备的抗血清具有良好的免疫活性,为下一步以LTB作为佐剂的黏膜疫苗研究提供基础材料。     

PEDV ps420片段乳酸乳球菌表达及免疫中和活性检测

将猪流行性腹泻病毒LJB/03株S基因上编码中ps420(1 495～1 916 bp)基因片段插入乳酸乳球菌pNZ8112中,构建了重组表达载体pNZ8112-ps420,将其电转化入乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000,获得了表达猪流行性腹泻病毒S基因ps420的重组乳酸乳球菌,经乳链菌肽(...     

应用PRV VP6蛋白McAb间接免疫荧光法检测猪轮状病毒

猪轮状病毒病是由呼肠孤病毒科的猪轮状病毒（PRV）引起以腹泻和脱水为特征的一种急性肠道传染病。     

表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究

为探究表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对雏鸡抵抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的作用,本研究利用IBDVCEF94株感染DF-1细胞,通过CCK-8法检测病毒感染后的细胞活性,利用qRT-PCR检测病毒载量,结果显示重组乳酸菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖;以重组乳酸菌pPG-XLFEC/M11饲喂雏鸡,利用IBDV强毒UK661株进行攻毒实验,结果显示饲喂重组菌的雏鸡相比于对照组,IBDV的感染对其组织器官的损伤较小,总免疫球蛋白IgG和SIgA含量增加,细胞因子IL-6、IL-8、TNF-琢和IFN-酌以及TLR2的mRNA转录水平均显著升高,且提高了雏鸡的存活率。本实验结果表明,重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽可以增强机体的免疫应答水平,对雏鸡具有一定的抗IBDV感染的作用。本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及为禽类疾病的预防奠定基础。