重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌

为建立创伤弧菌的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法,根据编码创伤弧菌DNA促旋酶的B亚单位蛋白(Gyrase Beta Subunit,gryB)的基因保守序列,设计RPA特异性引物,建立创伤弧菌gryB基因的RPA检测方法并测试其特异性、灵敏度和应用效果。结果发现,建立的RPA检测方法特异性好,能够从创伤弧菌中检测到234 bp的特异性条带,仅需在37℃下恒温反应40 min,不需要特殊的仪器设备;该方法的灵敏度与PCR相当,可达到0.1 ng/μL,应用检测结果也表明该方法与传统培养方法相当。因此,本研究建立的RPA方法检测gryB特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室快速检测。     

进境玉米中玉米内州萎蔫病菌PCR检测方法评估

为了准确检测玉米样品中玉米内州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis,Cmn）,减少测试过程中的假阳性和假阴性结果,利用15对Cmn特异性引物/探针分别测试了Cmn及其他菌株63株,并测试了食用、种用和饲用进境玉米样品300个。测试结果表明,常规PCR和实时荧光PCR方法阳性检出率最高的引物/探针分别是引物PSA-7/PSA-R和探针Cmn-MGB;巢式PCR不适用于样品中Cmn的检测;检测过程中引物Cmn-4F/Cmn-4R和探针rpsJ27P出现假阴性,引物CmnFP/CmnRP出现假阳性。根据测试结果,引物PSA-7/PSA-R和探针Cmn11-P可用于口岸进境玉米样品Cmn检测。     

基于最大熵模型预测小火蚁在我国的适生区

小火蚁是中国大陆新发现的重要外来入侵害虫, 目前对该虫的传入来源和在我国的适生区范围尚不明确?为明确我国小火蚁适生区范围, 有效防控该虫在我国的扩散和蔓延, 本研究通过该虫全球已有的分布数据, 采用最大熵模型对其适生区进行了预测?研究表明, 最大熵模型预测小火蚁适生区精度较高?预测结果显示, 我国小火蚁的潜在适生区主要分布于南方, 其中, 高适生区分布在台湾?海南?云南南部边境?广西西南局部?福建西南部?广东南部及其沿海地区?预测结果与该物种现有地理范围的生态条件一致?年降水量对小火蚁的适生性影响最大, 理论年降水量为2 040 mm时小火蚁分布的概率最高?随着全球气候变暖, 未来我国小火蚁的适生区有向北扩大的趋势, 但主要适生区还是以南方为主?     

油菜茎基溃疡病菌LAMP-HNB 检测方法的建立

油菜茎基溃疡病菌是油菜上最严重的真菌病害之一,是我国重要的检疫性有害生物。因此为防范其危害我国油菜产业生产安全,建立油菜茎基溃疡病菌的快速筛查方法具有重要意义。基于环介导等温扩增法(LAMP),以ITS(内转录间隔区)为靶序列并结合指示剂羟基萘酚蓝(HNB)建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的油菜茎基溃疡病菌的快速检测方法,并对其特异性、灵敏性进行评价以及实际样品进行检测。结果显示,该方法在62℃等温条件下仅需80 min即可通过肉眼直接目测试验结果。LAMP-HNB法与标准PCR检测方法对比显示其具有良好的特异性以及更高的灵敏度,利用该方法对10批油菜籽样品进行检测,共检出5批阳性样品,与标准中PCR检测方法结果一致。该方法的建立为油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定提供了新途径。     

油菜茎基溃疡病菌DPO-PCR检测方法的建立

根据油菜茎基溃疡病菌ITS基因序列,设计特异性DPO引物,建立检测油菜茎基溃疡病菌的DPO-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性进行评价。结果显示与常规PCR检测方法相比,DPO-PCR反应对退火温度不敏感,具有更强的特异性。利用该方法对10批油菜籽样品进行检测,共检出5批阳性样品,检测结果与常规PCR一致,为油菜茎基溃疡病菌的检测提供了新方法。     

基于多重串联式PCR的基因碟片技术检测转基因作物

【目的】建立基于多重串联式PCR（multiplexed tandem PCR，MT-PCR）的基因碟片技术，并使之应用于转基因作物的大量、快速和稳定地检测。【方法】以转基因作物研究中常用的调控序列NOS终止子、FMV35S启动子及外源基因NPTⅡ、Cry1Ab、Cry1Ab/Ac、CP4-EPSPS、PAT和玉米内源基因IVR、棉花内源基因sad1、菜籽粕内源基因PEP为检测对象，针对每个基因设计内外2对引物，先进行一次循环数较少（10—20 cycles）的高通量多重PCR，以便在均匀地扩增各基因和调控序列的同时避免引物之间的竞争，然后利用巢式荧光定量PCR检测各个基因和调控序列，最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。【结果】该方法能够快速（＜2 h）、高通量、准确地（＞0.000292 ng）检测出棉花、玉米、大米、菜籽粕中的多种转基因成分，可以分辨出3种转基因物种，适合大批量检测。【结论】该方法适合转基因作物的高通量、定量检测，具有较好的应用前景。     

T-RFLP指纹图谱技术分析细菌型微生物肥料菌种稳定性

[目的]建立一种分析微生物肥料菌种稳定性的T-RFLP指纹图谱技术。[方法]采用T-RFLP指纹图谱技术对进口细菌型微生物肥料菌种的稳定性进行分析。[结果]样品中优势菌的T-RFs片段主要是87、246、247、330 bp,其中330 bp为主要片段,Shannon多样性指数和均一性指数测定结果表明,不同批次产品间差异性较小,微生物群落结构较稳定。[结论]建立了微生物肥料菌种稳定性分析的T-RFLP指纹图谱技术,为进出口微生物肥料产品提供了一种快速分析方法。     

土壤中梨火疫病菌实时荧光定量PCR检测及动态分析

【目的】利用实时荧光定量PCR检测土壤中梨火疫病菌(Erwinia amylovora)浓度，明确梨火疫病菌在土壤中的动态变化规律。【方法】2021年3—11月采集库尔勒市发病香梨园810份土壤样品，应用所建立的实时荧光定量PCR检测体系，测定土壤中的梨火疫病菌浓度，同时对梨园发病率及病情指数进行调查。【结果】土壤中梨火疫病菌浓度值变化趋势与梨园病情指数变化趋势一致，4—5月梨园病情指数快速升高至最高值，随着果树生长期延长，病情指数逐渐降低。土壤中梨火疫病菌浓度值从4月逐渐升高，6月平均浓度值为914 CFU·g-1,7月平均浓度值最高为965 CFU·g-1，随后逐渐降低；6月土壤带菌率为42.2%，浓度值≥103CFU·g^-1的土样13份；7月土壤带菌率为44.4%，浓度值≥10³CFU·g^-1的土样26份；6月、7月土壤中梨火疫病菌浓度显著高于4月、10月、11月，致病风险较高。【结论】6月和7月土壤中梨火疫病菌浓度值最高，主要与4月、5月大量病花病果掉落造成病原菌积累有关。加强花期病害防治和梨园病残体清理可有效降...     

番茄褐色皱果病毒SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)外壳蛋白(coat protein,CP)的保守基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒种子进行了检测验证。结果表明,构建的实时荧光RT-PCR检测ToBRFV阳性的番茄种子总RNA和重组质粒标准品的检测低限分别为0.2 ng/μL和50.0拷贝/μL,均为普通RT-PCR检测灵敏度的100倍;对番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)、番茄环斑病毒(tomato ringspot virus,ToRSV)、番茄黑环病毒(tomato black ring virus,TBRV)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)、辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)和烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus,TRSV)等7种病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。对50份疑似感染了ToBRFV的番茄和辣椒种子样品检测结果表明,与常规RT-PCR和已报道的2种实时荧光RT-PCR方法相比,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点,适用于低丰度ToBRFV的种子检测。     

向日葵茎溃疡病菌RPA检测方法的建立

向日葵茎溃疡病菌(Diaporthe helianthi)是我国进境植物检疫性病原真菌。本研究针对D.helianthi的cal基因保守序列设计特异性引物,建立该病菌的重组酶聚合酶扩增检测技术(RPA)方法,并对其特异性、灵敏度及适用性进行评价。结果显示,建立的RPA方法特异性强,只有3个D.helianthi样品能够检测到234 bp的目的片段;方法灵敏度达到0.1 ng/μL;从模拟带菌的种子中也能够成功检测到目标扩增片段。本研究建立D.helianthi的RPA检测方法具有较高的特异性和灵敏度,能够直接应用于种子带菌检测,适用于口岸进境向日葵籽的现场快速检测。