MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析

血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的UL49h基因编码病毒被膜蛋白VP22在病毒的复制和传播过程中具有非常重要的作用.根据已发表的MDV-1 GA株的序列,从CVI988/Rispens弱毒株感染的鸭胚成纤维细胞中扩增VP22基因片段,结果获得大小为732 bp的PCR产物.将PCR产物克隆T载体并测序分析,结果发现,与经典强毒GA株相比,弱毒株CVI988的VP22存在3个定点突变和一个缺失性突变.缺失的位点亲水性强,并位于VP22主要的抗原决定簇区.结果证明强毒株与弱毒株的VP22存在明显差异,为利用CVI988 VP22的蛋白传导域传导目的蛋白奠定了理论基础.     

Ⅰ型马立克氏病强弱毒株Meq基因的克隆与序列分析

[目的]为获得MDV-1强弱毒株Meq基因序列的差异。[方法]根据GENE BANK登录的马立克氏病毒Meq基因序列,设计一对引物,采用PcR技术对MDV—Ⅰ型国内商用CVI988／Rispens疫苗株和参考强毒京-1（BJ-1）株的Meq基因进行了扩增,并将扩增产物提纯后克隆到pcDNA3．1（＋）上,进行酶切鉴定及测序验证。[结果]CVI988疫苗株和BJ-1强毒株的Meq基因开放阅读框（ORF）长度分别为1200和1197bp。通过与国际标准强毒GA株Meq基因进行比较,BJ-1株和CVI988株Meq基因中分别有一段180和177bp的插入序列,第211住核苷酸由G变为T,导致第71位氨基酸由丙氨酸A变为丝氨酸S;同时,CVI988株Meq基因第228位核苷酸由A变为G,导致第77位氨基酸由赖氨酸K变为谷氨酸E。此外,与BJ-1株相比,CVI988株Meq基因在576～578bp之间缺失3个碱基（ACC）,并导致第193位脯氨酸P的缺失,该突变发生在一个多脯氨酸重复区域内。[结论]MDV-1强弱毒株Meq基因序列存在明显差异,为从其分子水平进行区分及生物学功能的研究奠定了基础。     

马立克氏病病毒河南分离株Meq基因的克隆与序列分析

【目的】了解马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)河南分离株Meq基因的分子特性,为中原地区MDV流行情况提供较详细的信息,为更好地防控MD奠定基础。【方法】应用PCR方法分别扩增了17株MDV河南省野毒分离株的Meq基因片段,克隆测序后,将各毒株Meq基因序列与vv+MDV 648A株、vvMDV RBIB株、vMDV GA株、mMDV疫苗株CVI988株和814株的Meq基因序列进行比对分析。【结果】17株分离株中除HNGS201和HNLC503的Meq基因扩增产物较预期稍大外,其余15个的片段长度为1 020bp,与预期长度相符;MDV河南分离株之间及其与参考毒株Meq基因的核苷酸同源性为99.0%~100%,部分毒株Meq基因的氨基酸序列有10个位点的氨基酸存在规律性突变;MDV河南分离株和参考株共组成3个进化分支,其中强毒株GA、RB1B和648A位于一个分支,分离株HNGS201、HNLH304、HNLC503与mMDV毒株CVI988和814位于同一分支,其余14株分离株位于另一个较大的分支。【结论】河南省可能流行着不同毒力的MDV,一些mMDV毒株的Meq蛋白存在59个或60个氨基酸的插入。     

超强毒RB1B株马立克氏病UL49基因的克隆和序列分析

鸡马立克氏病病毒UL49基因编码的被膜蛋白VP22在病毒的复制和传播过程中具有非常重要的作用。根据已发表的MDV-1 Md5株的序列，从马立克氏病超强毒RB1B株感染的鸡胚成纤维细胞中提取病毒基因组DNA，经PCR扩增UL49基因并克隆入pMD18-T Simple载体。RB1B株UL49基因经核酸序列测定分析，全长为750碱基。将RB1B株与Md5株和GA株的UL49进行比较，发现马立克氏病病毒强毒株间的UL49基因高度同源，为利用RB1B的UL49基因作为基因治疗的靶序列奠定了理论基础。     

猪细小病毒1型河南流行毒株的遗传进化分析

【目的】监测河南省猪细小病毒1型(porcine parvovirus 1,PPV1)的变异情况。【方法】采集自河南省鹤壁市和安阳市初产母猪的流产胎儿阳性样品，利用PCR方法鉴定获得2株PPV1流行毒株，经过全基因组测序，分别命名为CH/HN-H/2021和CH/HN-3/2021。通过分析同源性和构建遗传进化树分析PPV1全基因组、NS1基因、VP2基因的变异情况，并且比对分析NS1蛋白和VP2蛋白的氨基酸变异情况及非编码区基因缺失情况。【结果】2条序列的核苷酸相似性为99.9%;与46株国内外PPV1流行毒株全基因组的核苷酸同源性为93.5%～99.9%;NS1基因核苷酸同源性为98.6%～99.9%,NS1蛋白氨基酸同源性为98.2%～99.9%;VP2基因核苷酸同源性为98.4%～99.9%,VP2蛋白氨基酸同源性为98.3%～99.9%,说明本研究鉴定的毒株呈现遗传进化稳定性。本研究鉴定株与湖南及吉林毒株亲缘关系最近，而与河南原有毒株亲缘关系较远。在对NS1蛋白与VP2蛋白的氨基酸变异分析中发现，NS1蛋白发生6处突变，VP2蛋白发生7处突变，均在经典突变位点范围内，符合PP...     

不同毒株马立克氏病病毒囊膜糖蛋白gI基因的克隆与序列分析

根据马立克氏病病毒（MDV）国际标准株GA的基因序列，设计全盛一对引物，通过PCR技术，分别以弱毒株814和广西分离强毒株G2株基因组为模板，扩增获得预期大小的PCR产物，将PCR产物和pUC18分别经BamH I株和Sma I酶切后，连接、转化TG1，筛选获得了814－gI和G2-gI的基因克隆，将所得克隆进行测序，并将它们与已发表的MDV其他毒株gI的序列进行比较分析，获得了它们的同源性，绘制了系统发生树。     

IBDV超强毒株和弱毒株VP2基因同义密码子使用偏爱性研究

应用RT-PCR方法扩增并克隆了分离自河南省的30株IBDV超强毒和9株弱毒株VP2基因cDNA序列,研究IBDV超强毒和弱毒株的VP2高变区基因不同位点同义密码子的使用情况。结果表明,超强毒株和弱毒株除特定位点的特征性氨基酸不同外,在同义密码子的使用上也有明显的偏爱性。这预示着同义密码子的使用与VP2基因表达及其表达产物的空间结构有关,进而可能影响到IBDV的毒力。     

水貂肠炎病毒B株全基因克隆与序列分析

将水貂肠炎病毒基因组分4个重叠片段进行PCR扩增,并将产物克隆到pMD18-T载体中,测定基因组近全长序列。其中编码水貂肠炎病毒非结构蛋白基因(NS1基因)全长为2 007 bp,编码668个氨基酸;编码结构蛋白基因(VP2基因)全长为1 755 bp,编码584个氨基酸。序列分析结果表明:水貂肠炎病毒B株与犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒NS1序列之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.8%～99.2%和98.8%～99.2%,与其他细小病毒毒株VP2序列之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.5%～99.8%和97.8%～99.5%,与MEVantigenic type 2株在亲缘上有着最密切关系。     

猪嵴病毒VP1基因序列测定与分析

[目的]对猪嵴病毒(PKV) VP1基因进行测序与同源性分析,确认其可能来源,为今后的生物学特性分析及仔猪腹泻防治工作提供科学依据.[方法]采用RT-PCR对GXPKV-1毒株VP1基因进行克隆,运用DNASTAR软件包中Megalign程序对测序获得的VP1基因进行核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分析.[结果]GXPKV-1毒株ⅥP1基因全长762 bp,共编码254个氨基酸,与GenBank已公布的13株参考毒株VP1基因的核苷酸同源性为74.1%~85.4%,推导氨基酸同源性为81.1%~93.3%.根据VP1基因推导氨基酸序列进行系统发育进化分析,发现GXPKV-1毒株与Gansu-2012、JS1419等国内参考毒株同属于同一亚群,而与瑞士分离株Swine-S-1-2007、泰国分离株THA-2008、美国分离株H24-2012-USA及四川分离株CHN-SC-2011-02等的亲缘关系较远.[结论]猪嵴病毒GXPKV-1毒株起源于国内流行毒株的传播,在新的环境下虽然其VP1基因核苷酸发生变异,但由于同义翻译,推导氨基酸的同源性仍然较高,说明碱基突变并未引起蛋白结构的改变.     

火鸡传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆和序列比较

参考GenBank发表的传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了一对特异扩增IB-DVVP2基因的引物。以广西玉林发病火鸡群分离的IBDV野毒YL株为材料,以其基因组为模板利用RT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物,将VP2基因克隆于PUC119质粒上,得到重组PUC119质粒。并对VP2基因全序列测定、分析和聚类表明,YL株与欧洲超强毒株非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

猪细小病毒YL株序列分析及其 VP2基因原核表达

为对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)进行分子生物学研究,将该病毒YL株基因组分为4个重叠片段进行PCR扩增,并将扩增产物克隆到pGEM-T载体中,测定病毒基因组全长序列。另外,应用其中1对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原区域的片段,构建重组质粒pET-VP2,IPTG诱导表达。序列分析结果表明,PPV YL株和国内外PPV分离毒株NS1基因核苷酸同源性为97.8%～99.4%,氨基酸同源性为96.7%～99.5%,与国内外主要毒株VP2基因核苷酸同源性为98.7%～99.7%,氨基酸同源性为97.4%～99.8%。进化树分析表明,PPV YL株与BQ株(EU790641)毒株处在同一分支上,遗传距离最近。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量为56ku,经Western blotting检测具有生物学活性。     

广东地区口蹄疫病毒VP1和3A基因的序列分析

【目的】了解广东地区口蹄疫病毒(FMDV)的遗传变异情况,为我国FMDV流行病学的研究及防控提供基础数据。【方法】对2015—2016年间收集的广东地区猪的病料进行FMDV VP1和3A基因的扩增测序和序列分析。【结果】11株O型FMDV均属耿马谱系毒株,7株A型FMDV均属Asia型毒株。11株O型FMDV的VP1基因与流行毒株相比,GD-MM-3株与O/BY/CHA/2010株序列相似性最高,为95.3%;GD-1株、GD-MM-1株和GD-MM-3株与O/MYA/1/98株序列相似性最高,为90.8%。7株A型FMDV的VP1基因与流行毒株相比,A/GDMM/CHA/2013株与GD-3株序列相似性最高,为99.8%;A/HuBWH/CHA/2009株与GD-3株序列相似性最高,为91.4%。11株O型FMDV的3A蛋白不存在氨基酸的缺失,7株A型FMDV的3A蛋白存在较多氨基酸的缺失。【结论】广东部分地区FMDV基因型复杂,预防控制困难。     

马立克病病毒囊膜糖蛋白E基因的克隆及序列分析

用聚合酶链式反应（PCR）技术，从中国广西分离的马立克氏病病毒（MDV）N株和G2株基因组DNA中，扩增出MDV糖蛋白E（gE）抗原基因片段的1500bp编码序列，将PCR扩增产物在KpnⅠ和HindⅢ位点克隆进pUC18质粒载体中，以Dig标记的gE PCR产物作为探针做斑点杂交及酶切分析选到含MDV gE基因的目的重组质粒pMNE、pMG2E。通过酶切位点分析显示，两毒株的gE基因内部酶切位点与MDV－GA国际标准强毒株的酶切位点基本一致。对重组pMNE、pMG2E质粒进行部分序列测定，并用DNA Star软件分析，结果表明：插入序列与发表的GA株gE基因序列具有高度同源性，gE基因为高度保守基因。     

不同毒株马立克氏病病毒囊膜糖蛋白gI基因的克隆和序列分析

根据马立克氏病病毒 (MDV)国际标准株 GA的基因序列 ,设计合成一对引物。通过 PCR技术 ,分别以弱毒疫苗株 81 4和广西分离强毒株 G2 株基因组为模板 ,扩增获得预期大小的 PCR产物 ,将 PCR产物和 p UC1 8分别经 Bam H 和 Sma 酶切后 ,连接、转化 TG1 ,筛选获得了 81 4 -g I和 G2 -g I的基因克隆 ,将所得克隆进行测序 ,并将它们与已发表的MDV其他毒株 g I的序列进行比较分析 ,获得了它们的同源性 ,绘制了系统发生树     

猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP~+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。     

采用PCR-RFLP法鉴别IBDV强毒BC6/85株和弱毒B87株

选取传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒力代表株BC6/85和弱毒力代表株B87为研究对象,根据VP2基因保守区设计一对通用引物和两个限制性内切酶位点,分别扩增两个毒株的VP2基因,然后进行BamHⅠ和PstⅠ酶切,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)分析酶切产物,并进行特异性、敏感性和重复性检测.结果表明:所设计的引物均可扩增两个毒株的VP2基因,大小约856 bp;经BamHⅠ和PstⅠ酶切后,BC6/85株的PCR产物被BamHⅠ和PstⅠ切出166、242和449 bp大小的3个片段,而B87株仅被PstⅠ切出242和615 bp大小的2个片段,且重复性好,特异性强.可见,采用PCR-RFLP分析IBDV VP2基因的方法操作简单,是一种能够快速鉴别IBDV强、弱毒株的可靠方法.     

猪细小病毒NS1基因和VP2基因的克隆与序列分析

根据GeneBank 上发表的猪细小病毒(PPV)的基因组序列,分别设计扩增非结构蛋白NS1基因和结构蛋白VP2基因的特异性引物,采用PCR方法扩增PPV泰安株(PPV-TA)NS1基因和VP2基因.结果表明,PPV-TA NS1基因长1989 bp,编码662个氨基酸,与参考PPV NS1基因核苷酸同源性在98.3 %～99.9 %之间.PPV-TA NS1蛋白有3个糖基化位点分别是356NIS、446NFS、513NLT,除PPV Tomau/1/02在356位缺失了一个糖基化位点之外,PPV-TA与其他PPV参考毒株一致;这表明不同毒株NS1蛋白调节功能可能有差异.PPV-TA NS1蛋白的潜在磷酸化位点是Thr435和Ser473,与PPV参考毒株相同.NS1基因系统发生分析表明,PPV-TA与PPV china亲缘关系最近.PPV-TA VP2基因长1740 bp,编码579个氨基酸,与PPV参考毒株VP2基因核苷酸同源性在98.3 %～99.8 %之间.PPV-TA VP2蛋白的378D、383H、436S氨基酸残基决定了PPV的组织嗜性,与PPV-NADL-2和PPV-china相同,这表明这3个毒株的组织嗜性是一致的.但与其他PPV参考毒株有差异,这表明不同毒株在动物体内的组织分布是有差别的.PPV-TA VP2蛋白有9个线性抗原位点,与PPV NADL-2和PPV china的线性抗原位点是一致的,这表明具有相同的抗原特性.VP2基因系统发生分析表明,PPV-TA与PPV NADL-2亲缘关系较近.     

兔出血症病毒VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDV CD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT—PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97.5%,与其它毒株的同源性在92.0%~96.6%之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexico-89株同源性最高为99.4%,与其它毒株的同源性在96.6%~98.3%之间。     

定点突变麻鸡副黏病毒ZH-1株F基因及其鉴定

根据麻鸡副黏病毒ZH-1株F基因序列,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物(引物中含有突变位点)。应用重叠PCR延伸法,分3次PCR扩增F基因,从而得到突变后的F基因,命名为F变基因,将其克隆进入pGEM-T载体,并进行PCR、酶切测序鉴定,使突变后的F变基因编码的氨基酸裂解位点为112 Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Leu117,具有弱毒株的特点。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2基因缺失株RT-PCR检测方法的建立

为了快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) nsp2基因缺失流行株,在对不同PRRSV分离株nsp2基因核苷酸序列分析的基础上,设计了针对nsp2基因的1对兼并PCR引物和1条基因特异性反转录引物.RT-PCR试验结果表明,经典PRRSV S1毒株和高致病性nsp2缺失株SY0608毒株的PCR扩增片段的大小分别为768 bp和678 bp.特异性试验和敏感性试验证明,该检测方法特异性较好,但敏感性相对较低,可用于快速鉴别诊断PRRSV nsp2基因缺失毒株和经典PRRSV毒株.