MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失BAC克隆株的构建及其体外增殖特性

为构建缺失马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)Meq基因簇microRNAs(Meq-clustered miRNAs的突变株,本研究在vv MDV GX0101细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)克隆的基础上,采用Red/ET同源重组技术将Meq-clustered miRNAs的编码基因进行缺失突变,经PCR鉴定及序列分析证明Meq-cluster miRNAs序列成功缺失后,提取Δmeq-miRNAs BAC DNA,转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒拯救,用SYBR GreenⅠqRT-PCR检测病毒体外增殖特性。结果表明成功拯救出缺失MDV Meq-clustered miRNAs基因的感染性BAC克隆株GX0101Δmeq-miRNAs,且该缺失株与亲本株GX0101BAC具有相似的增殖曲线,Meq-clustered miRNAs是MDV体外复制的非必需基因。MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失感染性BAC克隆株的成功构建为进一步研究MDV Meq-clustered miRNAs在MDV致病和致肿瘤方面的作用奠定了基础。     

恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性

将恩诺沙星(ENR)偶联于载体蛋白BSA,形成完全抗原(BSA-ENR)并免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术制备分泌抗恩诺沙星的杂交瘤细胞株,用体内诱生腹水法生产ENR单克隆抗体。结果筛选出4G1-B3,4G1-G1和4G1-B9 3株敏感特异的杂交瘤。3株单抗对ENR的半数抑制浓度(IC50)分别为1.04 ng/mL,2.44 ng/mL,4.24 ng/mL。4G1-B3与环丙沙星有0.02%的交叉反应,与其他竞争物的交叉反应率均小于0.01%;4G1-G1和4G1-B9与其他竞争物的交叉反应率均小于0.01%。     

抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争ELISA试剂盒的研制

利用合成的完全抗原(BSA-ENR)免疫小鼠,通过细胞融合技术和间接竞争ELISA筛选出了能分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以此为基础研制恩诺沙星残留检测的竞争ELISA试剂盒(competitive ELISA ENR-Kit),并测定其性能。结果表明:筛选出的2株杂交瘤细胞,单抗亚类均为IgG1型,其中4G1-B3株的ENR mAb间接ELISA效价为1:1.024×106,亲和常数(Ka)为9×1010L/mol;竞争ELISA试剂盒的线性检测范围为0.05~101.6μg/L、灵敏度0.05μg/L、半数抑制浓度(IC50)1.1μg/L,与其他化合物的交叉反应率(CR%)均小于0.01%,鸡肉样、鸡肝样、鱼肉样和牛奶样的平均添加回收率分别为81.5%8、7.6%、84.3%和95%,不同基质添加恩诺沙星标准品做竞争ELISA对ENR-Kit检测结果影响小,试剂盒保存期6个月以上。结果说明该竞争ELISA试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点,适用于ENR残留的快速检测。     

马立克氏病病毒编码的miR-M12-5p对鸡HVCN1基因表达的靶向调控

为研究miR-M12-5p在马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染过程中的调控作用,利用生物信息学方法对其候选靶基因进行预测分析,发现4个miR-M12-5p的结合靶点。体外双荧光素酶报告试验结果表明,miR-M12-5p可结合宿主鸡的氢离子电压门控通道1(HVCN1)基因mRNA的3'-UTR相应位点并发生特异性相互作用。实时荧光定量PCR分析进一步证实,miR-M12-5p能够在体内下调HVCN1基因的表达水平。上述结果表明,miR-M12-5p可以靶向调控宿主基因HVCN1的表达。     

抗谷胱甘肽-S-转移酶(GST)单克隆抗体的研制及初步应用

以纯化的谷胱甘肽转移酶标签蛋白(GST)免疫Balb/C小鼠,取免疫鼠脾细胞与NSO骨髓瘤细胞按常规方法融合,用纯化的GST经间接ELISA筛选,阳性孔经3次有限稀释法亚克隆,最终获得2株抗GST的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为4B7-F4和4B7-F4.间接ELISA检测4B7-E4、4B7-F4细胞培养上清的效价分...     

猪乙脑病毒河南分离株CSF.ZMD-3的分离鉴定及分子进化分析

采集河南省规模化猪场流产母猪死胎脑脊液作为样本,通过细胞盲传培养分离乙型脑炎病毒流行毒株,对新分离的病毒进行分子生物学鉴定,获得1株分离株并命名为CSF.ZMD-3。DNA序列测定及比对分析该分离株与已报道毒株基因的序列同源性,确定该分离毒株为乙脑病毒。使用MEGA3.1软件对CSF.ZMD-3毒株主要结构蛋白E蛋白的基因序列进行分子进化分析,确定CSF.ZMD-3为基因Ⅲ型乙脑病毒。     

IPMA筛选猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体方法研究

为了得到一种能够高通量检测细胞培养物的方法,并将其用于筛选特异性强、敏感度高的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体。用每孔能感染约100个细胞的病毒量接种单层覆盖96孔板的Marc-145细胞,12 h后用含3%H_2O_2的甲醇固定细胞,以制备免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)反应板。以100μL/孔的量将融合后继续培养10 d的杂交瘤细胞的培养上清加入至IPMA反应板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,以3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作为显色底物,于倒置显微镜下进行观察。结果表明,共筛选出1D1、7G8等39份PRRSV单克隆抗体,这39份单抗能够使PRRSV中高致病毒株HN07-1和经典毒株BJ-4感染的Marc-145细胞被特异性染色,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒感染的Marc-145细胞无交叉染色。因此,构建的IPMA方法能够敏感、准确地捕捉到PRRSV单克隆抗体。     

鸡马立克病疫苗株CVI988/Rispens meq基因编辑及缺失毒株的构建与鉴定

meq是鸡马立克病病毒（MDV）最重要的致瘤基因，在马立克病（MD）肿瘤发生中发挥关键作用。同时，它在疫苗株和强毒株之间具有明显的序列差异性。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以MDV疫苗株CVI988/Rispens meq基因为靶点，设计合成gRNA，克隆构建pX459-gRNA质粒，转染CEF并感染CVI988/Rispens，然后对meq基因编辑的病毒噬斑进行克隆纯化，经过PCR扩增、测序分析及IFA鉴定，成功构建1株meq基因编辑的缺失毒株CVI988Δmeq-C7，为后续筛选和鉴定抗MD疫苗株MEQ单抗及鉴别诊断研究奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白胞外区基因的原核表达、纯化及鉴定

利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。