鸡真核生物翻译起始因子2α的原核表达与多克隆抗体的制备

为了获得鸡源真核生物翻译起始因子2α(Eukaryotic translation initiation factor alpha two,eIF2α)的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了eIF2α基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-eIF2α。将其转化BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功表达出分子量约51 ku的重组融合蛋白。该融合蛋白表达时的最佳诱导时间、诱导温度和IPTG浓度分别为10 h、45℃和1.5 mmoL/L。通过对该蛋白进行Ni~(2+)柱亲和层析纯化,得到了较高纯度的重组蛋白。将纯化后的eIF2α蛋白免疫新西兰黄兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶8 000,试验结果为后续eIF2α蛋白功能的研究提供了帮助。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白的原核表达

本试验设计了M基因的特异性引物,扩增了M基因,成功构建了重组质粒,并转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件.结果表明,重组表达的融合蛋白Pet-32a-M大小约为43 ku,与预期大小相符.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,M蛋白为包涵体蛋白,且在IPTG浓度为0.8 mmol·L-1,温度为37℃,诱导时间为8 h的条件下,蛋白表达效果最佳.蛋白免疫印迹检测结果进一步显示,重组蛋白Pet-32a-M在体外可以被成功表达.     

鸡PERK的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(15~1 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的表达量最大.蛋白纯化结果表明,100 mmol·L-1咪唑洗脱液可较好地洗脱重组蛋白,获得较多的纯化蛋白.免疫结束后,抗体效价检测结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶32 000,可以与重组蛋白特异结合.     

采用PCR-RFLP法鉴别IBDV强毒BC6/85株和弱毒B87株

选取传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒力代表株BC6/85和弱毒力代表株B87为研究对象,根据VP2基因保守区设计一对通用引物和两个限制性内切酶位点,分别扩增两个毒株的VP2基因,然后进行BamHⅠ和PstⅠ酶切,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)分析酶切产物,并进行特异性、敏感性和重复性检测.结果表明:所设计的引物均可扩增两个毒株的VP2基因,大小约856 bp;经BamHⅠ和PstⅠ酶切后,BC6/85株的PCR产物被BamHⅠ和PstⅠ切出166、242和449 bp大小的3个片段,而B87株仅被PstⅠ切出242和615 bp大小的2个片段,且重复性好,特异性强.可见,采用PCR-RFLP分析IBDV VP2基因的方法操作简单,是一种能够快速鉴别IBDV强、弱毒株的可靠方法.     

新-法二联灭活疫苗免疫不同日龄商品蛋鸡的效果

为探讨新城疫-传染性法氏囊病二联灭活疫苗(ND-IBD二联灭活苗)对不同日龄商品蛋鸡的免疫效果,选择360只1日龄商品蛋鸡,分别于1、7日龄接种ND-IBD二联灭活苗,对照组接种灭菌生理盐水,分别于21-56日龄,每隔7d采血,分离血清,检测ND和IBD抗体水平,剖检取脾脏与法氏囊观察病变,荧光定量PCR检测免疫因子CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量,并进行攻毒保护试验。结果表明,1、7日龄商品蛋鸡接种ND-IBD二联灭活苗,其ND和IBD的抗体水平均有效提高,且在免疫后可以有效保护IBDV强毒的感染,但7日龄免疫效果更好。免疫因子的mRNA表达量检测结果表明,7日龄接种疫苗的免疫组免疫因子CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量明显高于对照组1日龄。综上,ND-IBD二联灭活疫苗7日龄免疫商品蛋鸡免疫效果更好。     

鸭坦布苏病毒LH株E蛋白基因的克隆与结构

采用分子克隆技术对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白基因进行克隆,同时运用多种生物学软件对该基因进行结构和生物学功能预测和分析.结果表明,本试验成功克隆了DTMUV LH株E蛋白基因,该基因包含一个1 500 bp的开放阅读框,编码500个氨基酸.遗传进化树分析表明,该蛋白与我国其他省份分离株的同源性很高.该蛋白的分子质量为54.3 ku,等电点为7.63,不存在信号肽序列,含有17个糖基化位点,有13个丝氨酸、4个络氨酸和8个苏氨酸的磷酸化位点.该蛋白存在跨膜区域,为亲水性蛋白.抗原位点分析表明,该蛋白有21个抗原肽段.本试验结果为E蛋白的生物学功能和致病机理的研究奠定重要的分子理论基础.