鸭瘟病毒强弱毒株TK基因的克隆及序列比较分析

根据GenBank中已发表的鸭瘟病毒TK基因序列,设计一对引物,对1株鸭瘟病毒强毒和1株鸭瘟病毒疫苗毒进行PCR扩增。将扩增的目的片段分别克隆到pMD18-T载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,获得阳性重组质粒,然后对阳性重组质粒进行序列测定及分析。结果表明,本实验所扩增的鸭瘟病毒TK基因及侧翼UL24基因大小为1 995 bp,鸭瘟强、弱毒株TK基因及侧翼UL24基因序列完全相同,该病毒TK基因与鸭瘟病毒其它毒株AY911509与AY963569,四川株DQ640611,AV1221株EF173464,sd-01株EF417996同源性分别为99.5%,99.9%,100%,99.9%,100%,而该病毒UL24基因与鸭瘟病毒其它毒株AY911511,DQ227739,EF417996同源性为99.9%,99.8%,99.9%,表明鸭瘟病毒强弱毒株TK基因及侧翼UL24基因高度保守。为构建鸭瘟病毒TK基因缺失的转移载体奠定了基础。     

一株鸭瘟病毒的分离与鉴定

从湖北省武汉市某种鸭场送检的死亡鸭肝脏中分离到1株病毒,结合流行病学调查,剖检病理变化特征初步诊断为鸭瘟病毒感染。根据Gen Bank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列设计一对引物,提取病毒核酸DNA进行PCR扩增,得到大小约为416 bp的目的片段。测序结果表明与Gen Bank上公布的鸭瘟病毒UL6基因的序列相似性达到99%。鸭胚感染试验表明,感染的鸭胚在第四天开始死亡,并出现典型的鸭瘟病毒感染症状。上述结果表明,该种鸭场种鸭死亡是由鸭瘟病毒所引起的。     

鸭出血性卵巢炎病毒RT-PCR检测方法的建立

参照(GenBank上登录的黄病毒科黄病毒属Ns5基因片段序列设计引物,建立能检测引起鸭出血性卵巢炎病毒的RT-PCR方法.该办法能从鸭出血性卵巢炎病毒扩增出1条约470 bp的特异性片段,从H9亚型禽流感病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽Ⅰ型副粘病毒均不能扩增出目的片段;敏感性试验显示建立的RT-PCR...     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因重组鸭瘟病毒载体的构建

为了构建含有Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒,将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP)进行改造,在其绿色荧光表达盒内插入Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因,将重组后的转移载体( pBlueSK-TK-EGFP-VP1)转染已感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞.原始病毒液在鸭胚成纤维细胞上盲传3代后...     

鸭瘟病毒囊膜糖蛋白gH的原核表达和免疫印迹

根据鸭瘟病毒包膜糖蛋白H（gH）基因序列设计3对引物,PCR扩增的基因片段分别定向插入到原核表达载体pET28,构建了3种原核表达质粒pET-gH、pET-gH1347和pET-gH1707,并转化宿主菌BL21（DE3）。结果显示,去除了gH跨膜区和信号肽的gH基因片段（pET-gH1347和pET-gH1707）获得了表达,而全基因片段（pET-gH）未获得表达。Western-blot表明2种表达产物均能与鸭瘟病毒阳性血清发生特异性反应。鸭瘟病毒gH蛋白的成功表达,将有助于开展该基因功能的研究和血清学检测方法的建立。     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。     

表达马立克氏病病毒gI基因重组鸡痘病毒的免疫原性

以鸡痘病毒为载体，构建含马立克氏病病毒（MDV）gI基因的重组鸡痘病毒（rFPV)，并在鸡胚成纤维细胞（CEF）中表达gI基因，用重组FPV（命名为rFPV-MDV648gI）感染CEF，结果显示：rFPV-MDV648gI能在CEF中稳定复制。进一步用rFPV-MDV648gI接种无特定病原（SPF）鸡皮下组织，结果表明：鸡对rFPV-MDV648gI具有抗体反应性。     

新城疫病毒F和HN核心片段在杆状病毒中的表达

为研制抗新城疫病毒的基因工程疫苗,将新城疫病毒F48E8株F和HN基因的核心片段克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,然后转化到DH10Bac感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组,最后将重组子转染TN5细胞,得到含F片段和含F HN片段的重组杆状病毒rBac F和rBac F HN。PCR扩增结果证实F和F HN基因片段重组到杆状病毒基因组中;SDS-PAGE和Western blot检验结果表明F和F HN基因片段在重组病毒中得到了表达。     

鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的基因序列设计、合成引物,以山东、江苏、广东等地分离株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到预期大小的目的片段.将山东分离株扩增的目的片段克隆到pGM-T载体,酶切鉴定得到阳性重组质粒.对重组质粒进行序列测定,与参考毒株R85952的序列比较发现,山东分离株与参考序列的同源性为974%.试验结果表明,所建立的RT-PCR方法最低模板检出量为100 pg,且该方法只能特异地检测出DHV,不能检出鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒和番鸭细小病毒等.自然感染病料的检测分离结果表明,该方法既可用于DHV-Ⅰ分离株的快速鉴定,也可用于临床感染病例的检测与诊断.     

Cloning of Thymidine Kinase Gene of Duck Plague Virus Using Degenerate PCR

The DNA of duck plague virus （DPV） thymidine kinase （TK） gene was cloned and sequenced from a vaccine virus in the study. Degenerate oligonucleotide primers for the consensus site of herpesvirus UL24, TK, and glycoprotein H（gH） gene were used in the polymerase chain reaction （PCR） to amplify DNA product with 3 741-base-pairs （bp） in size. DNA sequence analysis revealed a 1 077-base-pairs （bp） open reading frame （ORF） encoding a 358 amino acid polypeptide homologous to herpesvirus TK proteins. The predicted TK protein shared 31.2, 41.3, 35.7, 37.4, and 28.4% identity with herpes simplex virus typel, equine herpesvirus type 4, Marek＇s disease virus 2, herpesvirus turkey, and infectious laryngotracheitis virus, respectively. Comparison of the amino acid sequences of other herpesvirus TK proteins showed that these proteins were not conserved on the whole, otherwise the portion of the TK proteins corresponding to the nucleotide binding domain and the nucleoside binding site were highly conserved among herpesvirus. Comparison with the amino acid sequences of the conserved nucleotide and nucleoside binding domains of other eleven herpesvirus TK proteins to the predicted DPV peptide confirmed its identity as the DPV TK protein.     

猪圆环病毒II型ORF2基因克隆及其在E.coli中的融合表达

[目的]研究猪圆环病毒2型ORF2的基因克隆及其在E.coli中的融合表达。[方法]参照猪圆环病毒2型ORF2序列设计引物,应用PCR技术扩增出猪Ⅱ型圆环病毒河南株ORF2的部分基因。将其同IL-2的全基因一起连接PBV220载体并转化到E.coliJM109。阳性菌用温度诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析。[结果]结果表明,ORF2基因同IL-2的全基因在E.coli中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为44 kD,可以被猪PCV2阳性血清特异性识别。[结论]该研究为PCV2的检测和疫苗的研制以及综合防制奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒ORF5基因的克隆与表达

用RT-PCR方法从河南分离的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)变异株(HN07-1)中扩增ORF5全长基因,将其克隆至pMD19-T载体。测序结果表明,该序列与标准美洲株VR-2332同源性为89%,与我国早期分离的BJ-4株同源性为88%,与HB-1、JXAI变异株同源性为96%和99%。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-Blot结果表明,成功表达了41.5 kD的融合蛋白。     

PRRSV陕西分离株ORF5基因克隆、序列分析及原核表达

克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因,并进行序列分析及原核表达。根据GenBank公布的PRRSV ORF5基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV陕西分离株糖基化囊膜蛋白基因ORF5,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。再设计另外1对引物扩增ORF5缺失编码N端31个氨基酸残基的基因片段,将截短的ORF5基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行原核表达。结果扩增到603 bp的PRRSV全长ORF5基因,序列分析表明,分离株与北美型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%。因此推测陕西分离株属于北美型。SDS-PAGE可检测到大小约为38 ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。West-ern-blot分析表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。     

PRRSV陕西分离株ORF3基因的克隆、序列分析及原核表达载体的构建

根据GenBank公布的PRRSVORF3基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV陕西分离株ORF3基因,将其克隆入pGEM-T载体中,测序并进行序列分析。再将ORF3基因亚克隆入pET-32a中,构建原核表达载体。结果扩增到765 bp的PRRSV全长ORF3基因,序列分析结果表明,分离株与SY0608亲缘关系较近,而与CH-2、HB-2关系较远。重组原核表达质粒经酶切鉴定正确后命名为pET-GP3,为进一步研究GP3蛋白的原核表达、免疫特性、结构与功能奠定了基础。     

Cloning and Sequence of Glycoprotein H Gene of Duck Plague Virus

The glycoprotein H （gH） gene homologue of duck plague virus （DPV） was cloned by degenerate polymerase chain reaction （PCR） and sequenced. It was located immediately downstream from the thymidine kinase gene （TK）. In addition, the 3＇-end of the gene homologue to herpesvirus UL21 was located downstream from the gH gene. DPV gH gene open reading frame （ORF） was 2 505 bp in length and its primary translation product was a polypeptide of 834 amino acids long. It possessed several characteristics of membrane glycoproteins, including an N-terminal hydrophobic signal sequence, an external domain containing eight putative N-linked glycosylation sites, a C-terminal transmembrane domain, and a charged cytoplasmic tail. Comparison with other herpesvirus revealed identities of 20.2, 25.1, 23.0, 23.0, 26.5 and 26.0% with the gH counterparts of the human herpesvirus virus 1 （HSV1）, equine herpesvirus 4 （EHV4）, bovine herpesvirus 1 （BHV1）, pseudorabies virus （PRV）, gallid herpesvirus 2 （GHV2） and gallid herpesvirus 3 （GHV3）, respectively.     

豫西地区PRRSV新近流行株ORF5基因变异及Nsp2基因特征分析

为研究豫西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)新近流行株ORF5基因的变异情况及Nsp2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了26份近期采自豫西地区猪场疑似PRRS猪肺脏样品中的ORF5全序列和Nsp2部分序列,并对其生物信息学和结构进行了分析。结果表明:成功扩增出的21株PRRSV流行株间ORF5全基因同源性为96.6%～100%,氨基酸同源性为97.5%～100%;与参考毒株JXA1、MLV、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为96.6%～98.9%、88.4%～89.2%、88.0%～89.5%和66.8%～67.3%;对阳性病料进行了部分Nsp2基因的扩增,测序结果显示,所有流行株的Nsp 2基因与已报道的美洲株VR-2332相比,不存在核苷酸的插入或突变,但存在2个位点共90个碱基的缺失;遗传衍化分析表明,流行毒株属于美洲型。研究结果揭示了豫西地区新近流行的PRRSV ORF5基因的变异情况及Nsp 2基因的特征,为该地区的PRRS防控工作提供了理论依据。     

洋葱查尔酮合成酶基因的分子克隆和表达分析

查尔酮合成酶是类黄酮类物质合成的关键酶。本研究克隆了洋葱的查尔酮合成酶基因AcCHS1和AcCHS2。AcCHS1的ORF序列1182 bp,编码393个氨基酸残基;AcCHS2的ORF序列1 176 bp,编码391个氨基酸残基。在同等条件下,AcCHS2基因的表达明显高于AcCHS1。     

河南省及周边地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为了解河南及周边地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学情况,运用PCR方法对2014—2015年采集到的河南及周边地区山东、山西、河北、甘肃5省共158份病料进行PCV2检测,将PCR扩增得到的PCV2 ORF2基因片段进行测序,分析研究PCV2遗传变异情况。结果显示,158份样品中,有69份样品为PCV2阳性,得到19株病毒的ORF2基因序列;将检测到的PCV2 ORF2序列与国内外分离株进行比对发现,核苷酸序列的同源性为89.9%~99.9%,其氨基酸序列同源性为88.0%~99.6%。综上可知,河南及周边地区PCV2流行广泛,病毒变异频繁。     

PRRSV河南株ORF7基因的克隆表达及条件优化

从猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)河南分离株(HN07-1、HN07-2)的细胞培养物中提取RNA,根据参考株IAF-exp91 N蛋白基因序列设计出2对引物,成功克隆出ORF7全长基因,并连接至pMD-19T栽体.基因测序结果表明,2株PRRSV河南分离株ORF7基因序列完全相同;该序列与HB-4(hs)同源性为...