猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因克隆及其在E.coli中的融合表达

[目的]研究猪圆环病毒2型ORF2的基因克隆及其在E.coli中的融合表迭.[方法]参照猪圆环病毒2型ORF2序列设计引物,应用PCR技术扩增出猪Ⅱ型圆环病毒河南株ORF2的部分基因.将其同IL-2的全基因一起连接PBV220栽体并转化到E.coli JM 109.阳性菌用温度诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Westem-blot分析.[结果]结果表明,ORF2基因同IL-2的全基因在E.coli中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为44 kD,可以被猪PCV2阳性血清特异性识别.[结论]该研究为PCV2的检测和疫苗的研制以及综合防制奠定了基础.     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

猪圆环病毒是引起猪多系统衰竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO-HTb,转化BL21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

猪圆环病毒是引起猪多系统哀竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO—HTb,转化BE21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS—PAGE和Western—blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2 ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。     

白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF_2基因真核双表达质粒的构建

应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2) 的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA) 等方法验证基因的表达情况.结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基凶的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2.     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。     

表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

【目的】以伪狂犬病病毒为载体，构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒，并研究其生物学特性。【方法】将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中，构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒，然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。【结果】利用检测PCV2 ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+，同时用Southern blotting证实外源基因PCV2 ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting结果显示重组病毒中PCV2 ORF2基因获得了成功表达。对重组病毒的生物学特性研究表明，重组病毒与其亲本株在不同细胞上的增殖滴度相当，且重组病毒对小鼠无致病性，免疫小鼠后可诱导机体产生抗ORF2蛋白的特异性抗体。【结论】重组伪狂犬病毒构建成功，且表达的ORF2蛋白具有免疫原性。     

猪Ⅱ型圆环病毒-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建(初报)

根据GenBank发表的PCV2序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2 ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到了表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215(C)。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪Ⅱ型圆环病毒和伪狂犬病毒候选疫苗毒株。     

嵌合猪圆环病毒的构建

[目的]为了构建猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的嵌合病毒,并为PCV2疫苗研究奠定基础.[方法]以PCV1基因组为骨架,将其衣壳基因替换为PCV2衣壳基因,来构建嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)DNA克隆,将PCV1-2 DNA克隆转染PK-15细胞以获得拯救病毒PCV1-2,并测定PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性.[结果]酶切和序列测定显示成功构建出PCV1-2 DNA克隆;免疫荧光试验和PCR检测显示成功获得拯救病毒PCV1-2,其效价达到1060 TCIDs0/mL以上;一步生长曲线显示PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性与其亲本病毒近似.[结论]成功构建了1种具有较高体外增殖能力的嵌合猪圆环病毒.     

猪圆环病毒2型GX-FSH株全基因组及ORF2的克隆与结构分析

参考GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)基因的全序列,利用反向PCR技术设计一对特异引物,用PCR方法扩增从本室分离的猪圆环病毒2型GX-FSH株全基因,另设一对引物扩增编码ORF2完整基因,将它们分别连接到pMD 18-T载体,筛选获得重组阳性质粒并对其测序分析。结果表明,所克隆的GX-FSH株全基因序列与Gen-Bank上已发表的部分PCV2毒株全基因序列同源性在94.6%~99.4%之间;相应ORF2开放阅读框的核苷酸同源性在90.0%~99.1%之间,氨基酸序列同源性为90.1%~98.7%;利用生物学软件对ORF2蛋白质结构特征分析,结果提示其成熟蛋白二级结构为β类结构。     

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和 TaqMan探针,构建分别包含 PCV2 ORF1和 ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于 PCV2 ORF1和 ORF2的TaqMan荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的 Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数 R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101 copies/μl,ORF2方法可达1.0×102 copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在 P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。     

河南省及周边地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为了解河南及周边地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学情况,运用PCR方法对2014—2015年采集到的河南及周边地区山东、山西、河北、甘肃5省共158份病料进行PCV2检测,将PCR扩增得到的PCV2 ORF2基因片段进行测序,分析研究PCV2遗传变异情况。结果显示,158份样品中,有69份样品为PCV2阳性,得到19株病毒的ORF2基因序列;将检测到的PCV2 ORF2序列与国内外分离株进行比对发现,核苷酸序列的同源性为89.9%~99.9%,其氨基酸序列同源性为88.0%~99.6%。综上可知,河南及周边地区PCV2流行广泛,病毒变异频繁。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达

为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

广西猪圆环病毒2型的遗传进化分析

【目的】了解广西各地当前流行的猪圆环病毒2型（PCV2）基因型差异、出现的时间、致病性及其今后流行趋势。【方法】根据GenBank中已发表的PCV2核苷酸全序列设计1对引物,从广西不同市（县）采集的猪组织样本（脾脏、肺脏、淋巴结、流产胎儿）中成功克隆获得34株PCV2 ORF2基因序列,并对其进行遗传进化分析。【结果】获得的34株PCV2中有9株ORF2基因全长为705bp,1株为696bp,其余的为702bp;经遗传进化分析,发现PCV2可以分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e5个基因型,在34株PCV2ORF2基因中,有7株属于PCV2d型,1株属于PCV2e型,25株属于PCV2b型,未发现PCV2a和PCV2c型,而新发现的GXHP-2不归属于任何一个基因型。【结论】广西目前流行的PCV2有PCV2b、PCV2d、PCV2e3个基因型,其中以PCV2b为主。     

2007年中国部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析

 【目的】对采集自上海、江西、山东、江苏、河南和湖南等省的257份进行了PCV2的检测,确定中国PCV2感染情况及分子特征。【目的】设计一对针对PCV2 ORF2的引物,利用PCR对其进行PCV2基因组的检测,对PCV2阳性的样品,进行了ORF2的克隆、序列测定和分析。【结果】结果显示PCV2阳性率为24.51%（63/257）,并能从健康猪群中检测的阳性;各PCV2分离株间ORF2核苷酸序列同源性为84.4%～100%,氨基酸同源性为82.5%～100%,与所属群的不同而不同。【结论】中国有2个群的PCV2毒株在流行,以PCV2b群为主（70.97%,22/31）,但也有PCV2a群毒株（29.03%,9/31）的流行,同时PCV2流行的基因型没有明显的地域间差异。部分毒株符合高致病性PCV2的特征,暗示中国已存在高致病性PCV2的流行。     

利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗

【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因,利用重组Cap蛋白制备PCV2 VLP疫苗的可行性。【方法】 根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体pQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析;利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装;利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量,利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比,得出目的蛋白量,将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg·mL^-1。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化,免疫2-3周龄抗原抗体双阴性的仔猪,同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组,免疫后14 d与21 d所有试验猪采血,分离血清,利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒检测试验猪血清中PCV2抗体水平;免疫后28 d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程序,利用PCV2 NJ株F₆代进行强毒攻击试验,肌肉注射与口服PCV2 NJ株各10^5.0TCID₅₀,同时利用乳化的钥匙孔血蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激,攻毒后25 d,对所有试验猪进行解剖检测,通过攻毒过程中试验猪体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方面评价大肠杆菌表达制备的PCV2 VLP的免疫效力。【结果】SDS-PAGE结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中;Western blotting分析结果显示表达的重组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反应;电镜下观察可见大量直径在17 nm左右的PCV2病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中;500 μg/头重组VLP疫苗免疫猪产生较高的抗体水平,单次免疫后21 d抗体100%达到合格,对PCV2强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达,重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒,且具有良好的免疫原性,可用于制备PCV2亚单位疫苗。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

参照Genbank上公开发表的PCV1全基因序列设计引物,以质粒pSK-PCV为模板扩增出PCV1-ORF2基因,插入pMD18-T载体,对筛选出的阳性质粒进行测序,将测序结果同Genbank上发表的PCV1基因序列相比较,同源性达97％,再与Genbank上发表的PCV2的ORF2基因序列相比较发现PCV1-ORF2和PCV2-ORF2的差异表现在两者在核苷酸序列的2个部位互相存在基因缺失现象。将推导出的PCV1-ORF2的氨基酸序列同PCV2-ORF2进行比较,发现二者在几个功能区相当保守,尤其是N-末端的核定位序列、N-糖基化位点以及酪氨酸磷酸化位点。     

猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因共表达对PPV病毒样颗粒形成的影响

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,得到了重组质粒pPI-2.EG-FP.VP2。再以含有PCV2 SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因,进一步将其插入pPI-2.EGFP.VP2中,构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的真核表达载体pPI-2.EG-FP.VP2.ORF2。用脂质体介导法将pPI-2.EGFP.VP2.ORF2 DNA转染Vero细胞,观察绿色荧光蛋白的融合表达,采用ELISA方法检测转染液与PPV、PCV2高免血清的反应特性,同时将转染出现绿色荧光明显的Vero细胞制备电镜样品。结果显示,VP2基因、ORF2基因与绿色荧光蛋白得到融合表达,转染液与PPV、PCV2高免血清具有良好的抗原抗体反应特性,电镜观察到重组病毒样颗粒的形成。     

7株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆及序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型的ORF2序列,设计l对引物,运用PCR方法,对中国动物卫生与流行病学中心监测室从福建、湖南和辽宁3省分离的7个毒株进行ORF2基因扩增.将其克隆到pGEM-T easy载体,筛选阳性重组质粒进行测序.应用DNAstar软件将测序结果与国内外参考毒株进行比对,并对Cap蛋白的细胞表位、糖基化位点等进行分析.结果表明,HUN、HUN-2和LN-19分离株ORF2基因大小为702 bp,编码233个氨基酸;FJ-3、FJ-4、HUN-11和LN-3的ORF2基因大小为705 bp,编码234个氨基酸.Cap蛋白5个表位区A(47～63)、B(65～87)、C(113～139)、D(165～200)和E(C端最后4个氨基酸)均发生一定变异.同源性分析表明,24株序列同源性为90.5%～99.9%,FJ-3与美国株同源性最低(90.5%),HUN和AF055393、DQl80392同源性最高(99.9%);FJ-3和FJ-4为94.5%,HUN-11和HUN-2为94.3%,HUN和HUN-2为99.3%,HUN和HUN-11为95%,LN-3和LN-19为94.7%,表明各地区ORF2基因比较稳定,但也存在一定差异.