江苏地区奶牛场blaNDM阳性大肠杆菌的分子流行病学

为了调查江苏地区奶牛场大肠杆菌中bla_(NDM)基因的分子流行病学特征。从江苏部分地区3个奶牛场采集样品134份,使用PCR和测序的方法筛选bla_(NDM)阳性大肠杆菌,同时对其进行超广谱β-内酰胺酶类基因的检测,采用药敏试验检测bla_(NDM)阳性大肠杆菌对19种常用抗生素的敏感性,通过多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对携带NDM基因的大肠杆菌进行亲缘关系分析,通过质粒结合试验验证bla_(NDM)基因的可转移性。结果显示,从134份奶牛场样品中共分离15株bla_(NDM)阳性大肠杆菌,包括NDM-1和NDM-5 2种变体。15株bla_(NDM)阳性大肠杆菌对多种抗生素均呈现不同程度的耐药,奶牛场15株bla_(NDM)阳性大肠杆菌包括7种ST型,分别是ST410、ST846、ST206、ST101、ST1642、ST3076、ST1626,同一种ST型在粪便样品和环境样品中同时存在,表明相同ST型bla_(NDM)阳性大肠杆菌可在动物与环境间相互传播。PFGE试验结果表明,15株bla_(NDM)阳性大肠杆菌可以分为11个簇,同一样品的分离株倾向于相同的簇,在比较小的范围内存在PFGE图谱相同的现象;对15株菌株的结合子进行bla_(NDM)基因的转移性试验结果表明,15株大肠杆菌的bla_(NDM)耐药基因均通过质粒结合转移至受体菌J53。表明,bla_(NDM)阳性大肠杆菌在江苏省部分地区奶牛场中流行相对较为严重,存在多重耐药现象,推测bla_(NDM)基因主要通过质粒结合转移的方式进行水平传播,这为食品源耐药菌的监测及风险评估提供了依据。     

猪流行性腹泻病毒变异株RT-PCR检测方法的建立

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引起猪呕吐、腹泻和脱水,各年龄段的猪均可发病,而哺乳仔猪发病和死亡最为严重。2010年末发生的仔猪腹泻综合征的主要病原为PEDV变异株。根据PEDV变异株S基因发生碱基缺失和插入的特征设计并合成了1对特异性引物,首次建立了PEDV变异株的RT-PCR检测方法。结果表明,所建立的PCR检测方法特异性强,不和PEDV经典毒株反应,也不与其他动物病原反应;敏感性较高,最低可检测10~(-3)ng/μL,且重复性较好。用该方法对2013—2014年我国华东地区猪场的318份临床样品进行检测,结果发现109份样品(34.3%)为PEDV变异株阳性,表明我国腹泻猪群中PEDV变异株感染较为普遍。本研究建立的PCR方法可以作为PEDV变异株在临床上的一种鉴别诊断技术。     

猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备及攻毒保护研究

为研究现用猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777疫苗毒株对流行毒株的免疫保护效果,以RTPCR进行PEDV CV777疫苗株、JS12流行株S基因克隆测序,进行PEDV S基因核酸序列分析与氨基酸序列分析。分别以转瓶工艺与细胞悬浮培养工艺培养Vero E6细胞,制备PEDV CV777株转瓶灭活苗与悬浮灭活苗。分别以PEDV转瓶灭活苗、悬浮灭活苗、PEDV流行株组织灭活苗(JS12株)产前30d免疫经产母猪;母猪产仔后14d进行仔猪攻毒保护试验。核酸序列分析显示,PEDV CV777株S基因与流行毒株的相似性在96.4%~99.7%之间,氨基酸序列相似性在96.7%~99.5%之间。转瓶工艺制备PEDV抗原效价为107.0 TCID50/mL,悬浮培养制备PEDV抗原效价为108.5 TCID50/mL。攻毒保护试验显示,悬浮灭活苗免疫母猪后,仔猪有2/10发病,保护率为8/10,转瓶灭活苗组发病率为8/10,保护率仅为2/10;组织灭活苗组9/10发病;对照组10头全部发病。该试验证明,提高PEDV CV777株的抗原含量,能够有效提高疫苗对PEDV流行毒株的保护效果。     

新城疫不同宿主源分离株的生物学特性

选择6株(鹅DC01、鸡WJ10001、鸽DZ01、鸽DZ02、鸭NJ10、鸭SD09)分离自鸡、番鸭、鹅、鸽的新城疫病毒,接种于10日龄无特定病原体(SPF)鸡胚中,通过测定鸡胚平均死亡时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)及融合蛋白(F)裂解位点氨基酸序列,研究其生物学特性和分子流行病学特征.结果显示,6个分离毒株均为新城疫病毒(NDV)强毒株.对F基因的序列测定和遗传关系分析表明,2株鸭源NDV强毒株(鸭NJ10、鸭SD09)与1株鸭源NDV山东流行毒株(鸭SDWF2005)高度同源；2株鸽源NDV强毒株(鸽DZ01、鸽DZ02)与1株鸽源DNA强毒株(鸽JS2000)高度同源.6株不同宿主源毒株的基因型分别为Ⅵ型和Ⅶ型,是中国目前流行的NDV毒株型.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白2基因克隆、序列分析及表达

参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniac)血清5型菌株序列ZA6774设计1对特异性引物，用PCR方法扩增转铁结合蛋白2(Tbp2)基因，得到1条1624bp的片段，然后克隆到pMD18-T载体中，经测序比较，与参考序列的核苷酸同源性达99．8％，从T-载体中切下目的片段后，定向克隆到pET32a( )中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，经诱导后，SDS-PAGE电泳，Tbp2高效表达，Western-blotting鉴定呈阳性。     

猪IL-1β与IL-18SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

IL-1β和IL-18是重要的促炎症细胞因子,在介导机体炎症反应中起重要作用.为了建立在体外定量检测猪细胞因子IL-1β和IL-18mRNA表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,依据GenBank中登录的猪细胞因子基因IL-1β、IL-18及管家基因β-actin核苷酸序列,设计特异性引物,经RT-PC...     

大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及生物学活性分析

从大肠杆菌K88（LT＋,ST＋）菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因（ltb）,得到454 bp片段,克隆至pMD18-T载体后,与pET32a（＋）定向连接,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG 30℃诱导表达重组LTB蛋白。SDS-PAGE显示,重组蛋白分子量约为34 kDa,超声波裂解后,表达产物主要以包涵体形式存在。经鉴定,纯化复性后的LTB蛋白保留部分与GM1结合的生物学活性。     

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将E．coli O157：H7（EHEC—O157：H7）用甲醛灭活、超声破碎，免疫BALB／c小鼠，制备免疫脾细胞；与SP2／0骨髓瘤细胞融合后，获得7株分泌抗E．coli O157：H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株，分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3，Ig亚类分别是IgG2ak、IgG2aK、IgG1K、IgMK、IgMh、IgMK和IgG2aK。用间接ELISA检测，E7和F1细胞培养上清液的效价为1．6×10^3，腹水效价均为1×10^11；C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×10^2，腹水效价均为1×10^3。相加ELISA结果显示，F1、G9和G113株mAbs对应相同的抗原表位，而其它4株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性，7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Westernblotting表明，c3、E7和F13株mAbs在蛋白分子量28×10^3处有特异性条带，而其它4株mAbs则未显示蛋白带。     

猪圆环病毒2型重组病毒ZJ-R感染性克隆的构建

利用无缝克隆方法构建ZJ-R全长基因组的单拷贝分子克隆以及双拷贝串联分子克隆;通过生物信息学技术预测ZJ-R病毒结构蛋白的B细胞抗原表位,人工合成选定的表位肽,然后偶联KLH免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;免疫组化试验证实该多抗与转染PK15细胞的ZJ-R双拷贝串联分子克隆具有反应性。结果表明构建的ZJ-R双拷贝串联分子克隆具有感染性。