BHK-21细胞稳定测定猪乙型脑炎病毒半数细胞感染量效价（TCID_（50））的条件优化及应用

为建立BHK-21细胞测定乙型脑炎病毒（Japenese encephalitis virus,JEV）病毒效价的方法,对96孔细胞板中不同初始接种量BHK-21细胞在多种维持液中的生长状态进行探讨,发现当BHK-21细胞以1250～2500个/孔接种96孔板培养24 h后,更换含3%新生牛血清的DMEM后在37℃、5%CO2条件下可至少良好维持72～96 h。在此条件下并基于Reed-Muench法测定病毒效价的原理,本文建立了准确测定JEV TCID50的方法,利用该方法对JEV野毒分离株及商品疫苗进行测定,均获得稳定、准确的病毒效价。本实验为JEV的体外培养、病毒定量、疫苗评价等提供了一种准确、稳定、易判定的参考方法。     

BHK-21单细胞克隆敏感株筛选及日本脑炎病毒分离

为筛选出日本脑炎病毒(JEV)敏感度高的BHK-21细胞株,采用终点稀释法从母代BHK-21混合细胞中分离单细胞克隆株,应用接种BHK-21克隆株方法,从JEV阳性蚊子样品研磨液中分离病毒,筛选出的3号单细胞克隆株经3次传代后细胞产生明显病变,分离到1株JEV,5号单克隆株培养物核酸检测呈阳性,但是不产生细胞病变,母代混合细胞没有病变,JEV核酸检测阴性。根据1、3型JEV的prM与E基因设计4对引物初步鉴定分离株基因型,鉴定分离株为1型JEV。综合以上结果,构建的BHK-21单细胞克隆株比BHK-21混合细胞对分离JEV株敏感,更适合JEV的分离与培养。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白。本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法获得1株特异性针对JEV E蛋白的杂交瘤细胞,命名为5D4,经测定5D4单抗亚类属于IgG2a,轻链为κ链。经Western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体可特异地与JEV E蛋白结合。结果表明,所制备的抗JEV E蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。     

Nrf2通路对日本脑炎病毒感染小鼠神经瘤细胞引起氧化应激反应的影响

旨在研究Nrf2/HO-1通路在日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)感染引起神经细胞损伤中的作用机制,本试验建立Nrf2激动剂叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone, TBHQ)处理JEV感染的小鼠神经瘤母N2a细胞的体外感染模型。N2a细胞四种处理分别为空白DMEM对照组(Control)、JEV感染组(JEV)、TBHQ处理组(TBHQ)、JEV感染+TBHQ处理组(JEV+TBHQ)。不同处理后观察细胞病变,检测ROS水平及MDA、SOD、CAT含量变化,利用qPCR和WB技术检测Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白的表达,并通过免疫荧光法检测各组细胞Nrf2蛋白表达情况,以及炎性因子及病毒含量。结果显示,JEV感染N2a细胞后随着时间延长ROS水平逐渐升高,且在36 h ROS水平最高。JEV感染后36 h Nrf2、HO-1的mRNA均升高,炎性因子水平升高。JEV感染N2a细胞后细胞皱缩,胞膜破裂,ROS、MDA水平升高,SOD、CAT水平降低;用40μmol·L^-1 TBHQ处理6 h后...     

河南省猪场蚊虫中Ⅰ、Ⅲ型乙型脑炎病毒的分离及鉴定

用Vero细胞对2010年河南省采集的猪舍蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙型脑炎病毒（JEV）进行分子生物学鉴定,并对其PrM基因进行克隆、测序及病毒进化分析。结果显示,从采集的蚊虫标本中分离到1株基因Ⅰ型JEV（HN10-1）和1株基因Ⅲ型JEV（HN10-2）。结果表明,河南省同时存在Ⅰ、Ⅲ2种基因型JEV的传播和流行。     

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID₅₀)的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID₅₀绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID₅₀、鸡胚半数感染量(EID₅₀)与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10^6.375 EID₅₀,细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID₅₀值为10^7.0/0.1 mL,EID₅₀为10^7.5/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

ST悬浮细胞培养猪伪狂犬病病毒工艺参数的优化

为优化ST悬浮细胞培养条件及其生产猪伪狂犬病病毒的工艺参数,对影响ST悬浮细胞生长的接种细胞初始密度、培养时间和摇瓶转速等工艺参数进行优化比较,对影响猪伪狂犬病病毒增殖的接种细胞初始密度、感染量和培养时间等条件进行优化。结果显示：接种细胞初始密度1.00×106 cells/mL、摇瓶转速140 r/min、悬浮培养48 h时,细胞数量扩增了4倍且细胞活力高;猪伪狂犬病病毒接种时初始细胞密度2.00×106 cells/mL、感染量MOI=1.0、培养60~72 h,毒价可达109.00 TCID50/mL。结果表明,优化后的培养工艺适用于摇瓶中ST悬浮细胞及猪伪狂犬病病毒的培养。本研究为获得高密度ST悬浮细胞和提高猪伪狂犬病病毒繁殖能力提供了试验依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪肺组织精细切片中感染特性的研究

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在猪肺脏组织中的感染特性,本研究建立了高度分化的猪呼吸系统体外培养模型-猪肺组织精细切片(PCLS)。该培养体系包含肺脏组织中多种相关细胞并能够体现出肺脏组织的生理结构和生物学功能。本研究针对制备的猪PCLS进行生物学活性的鉴定,利用评估支气管上皮细胞纤毛摆动百分比的方法检测支气管上皮细胞纤毛活性,结果显示猪PCLS制备良好,在制备10 d以后仍保持95%以上的纤毛活性;利用活/死细胞染色法测定制备的猪PCLS体外培养后活细胞的比例,结果显示制备的猪PCLS在体外培养7 d后支气管上皮细胞和肺泡细胞仍为活细胞;利用间接免疫荧光试验测定猪PCLS中上皮细胞、杯状细胞和肺泡巨噬细胞(PAM)的完整性与分布情况,结果显示制备的猪PCLS上皮细胞和杯状细胞保存完整且猪PCLS中包含丰富的PAM。利用6株不同PRRSV分离株(HuN4、XD-15、WK-34、WK-38、LCL-75和DL-1510)以2.5×10~5TCID_(50)/片的剂量感染猪PCLS,检测不同PRRSV分离株在猪PCLS中的感染特性,结果表明不同PRRSV分离株在该培养体系中表现出不同的增殖能力。本研究表明猪PCLS可用于PRRSV的体外感染试验。本研究为PRRSV的体外研究提供了新的模型与方法,同时也为其它猪呼吸道病原体提供了新的研究平台。     

天津及周边地区猪圆环病毒2型流行情况调查及分离鉴定

为了调查天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的感染情况及其分子特征,本研究应用PCR方法对疑似PCV2感染病例开展调查,将阳性病料接种dulac细胞分离病毒,应用PCV2 ORF2基因特异性引物对分离的PCV2进行PCR扩增,克隆、测序后进行核苷酸序列同源性分析。结果显示,不同地区PCV2的阳性率为25.0%~38.1%,其中夏季的阳性率明显高于其他3个季节,达到44.0%;不同阶段猪群中,育肥猪群的PCV2阳性率最高,而哺乳母猪相对较低。经细胞分离得到24株PCV2,其ORF2序列与GenBank中PCV2序列的同源性为87.8%~99.2%,24株分离株之间的同源性为89.4%~100.0%;遗传进化分析显示,24个分离株归属于2个分支。对其中一株分离毒株（Y16155-1株）的体外增殖特性研究表明,第4代接种dulac细胞后6 h即可检出PCV2核酸,72 h病毒含量达到高峰,病毒滴度为10^-4.3 TCID₅₀/0.2 mL。本试验结果为进一步研究该地区PCV2分子流行病学及相关疾病的免疫防控奠定了基础。     

广西Tanay病毒粒子形态观察

为了研究广西分离Tanay病毒粒子的形态特征,用2013年从广西马山县采集致倦库蚊标本分离的1株Tanay病毒(GX13M50)接种C6/36细胞进行复壮及培养、固定,采用超薄切片透射电镜对GX13M50病毒粒子进行形态学观察。结果表明:该分离株能够引起C6/36细胞产生明显病变,在接种96 h后,被感染的细胞聚集、折光性变强、脱落;感染细胞的超薄切片电镜观察结果表明,病毒粒子为椭圆形,直径大约50 nm,具有一个短的突起。本研究对Tanay病毒粒子的形态进行了研究,为该病毒的形态学诊断及防控提供依据。     

猪乙型脑炎病毒LS株的理化特性及其在BHK-21细胞上增殖特性的研究

对猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)LS株的理化特性及其在BHK-21细胞上的增殖特性进行研究,结果表明,该病毒对温度(56 ℃)、酸(pH 5.0以下)、乙醚、胰蛋白酶敏感,反复冻融(-65～20 ℃)3次几乎不影响病毒效价;该毒株在BHK-21细胞上连续传20代,仍能维持较高的病毒滴度(TCID₅₀=10^7.75/mL)和血凝效价(2⁸),且根据其在BHK-21细胞上的增殖规律,得到最佳收毒时间为接毒后28～40 h。本试验为进一步研究JEV LS株的生物学特性奠定基础。     

日本脑炎病毒弱毒疫苗株全长cDNA的体外合成及恢复病毒的拯救

将病毒的全基因组分成3个重叠的区段分别扩增出来,把这3个片段连接到载体中。以这3个片段为模板,通过融合PCR方法,获得JEV的全长cDNA。以cDNA为体外转录的模板,体外转录获得病毒mRNA,转染BHK-21细胞,拯救JEV病毒。通过生物学特性、分子生物学、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定,并测定恢复病毒的生长曲线和LD50。结果显示,获得了全长cDNA,体外转录获得的病毒RNA转染BHK-21细胞后,二代恢复病毒可引起明显的细胞病变,间接免疫荧光试验和RT-PCR均为阳性。空斑试验表明,拯救病毒与原病毒空斑表型类似;恢复病毒与亲本毒相比在BHK-21细胞上生长更快;恢复病毒的LD50与亲本毒类似。     

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒（PRV）敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID₅₀病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速120 r·min^-1、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达（7.61±0.18）×10⁶ cells·mL^-1、细胞活率为（96.93±1.18）%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速80 r·min^-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值（7.13±0.11） lgTCID₅₀·mL^-1。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。     

稳定表达TIGAR基因的BHK-21细胞系的构建及其对新城疫病毒增殖效果的评价

TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和抗细胞凋亡功能。由于新城疫病毒（NDV）引起细胞死亡是通过诱导凋亡产生,所以提高宿主细胞的抗凋亡水平,有助于延长细胞存活时间进而提高子代病毒的滴度。本研究根据GenBank中预测仓鼠TIGAR基因和鸡TIGAR基因设计引物,分别扩增仓鼠和鸡的TIGAR基因,并构建各自的慢病毒包装质粒,以适合NDV增殖的BHK-21细胞为基础构建稳定过表达TIGAR细胞系（BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR）。使用Western blot、DNA测序和qPCR对TIGAR基因表达水平进行鉴定,Western blot和流式仪检测细胞的自然凋亡率。选取新城疫病毒强中弱3种毒株分别感染构建的细胞系,测定病毒滴度。结果显示：重组细胞系BHK-21-chTIGAR细胞和BHK-21-hamTIGAR细胞经过Western blot和DNA测序等检测表明构建成功,TIGAR基因表达量高且无野生型BHK-21细胞污染。qPCR检测细胞系的稳定性结果显示,TIGAR基因在BHK-21细胞中经过30次传代均可稳定表达。Western blot和流式细胞检测结果显示：BHK-21-hamTIGAR细胞的凋亡率低于野生型BHK-21细胞和BHK-21-chTIGAR细胞;病毒生长曲线结果显示：强毒株ZJ1病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID₅₀（5.67,72 h）高于BHK-21-chTIGAR细胞（5.53,72 h）和野生型BHK-21细胞（5.27,72 h）;中强毒株SH15病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID₅₀（4.90,96 h）要高于BHK-21-chTIGAR细胞（4.57,96 h）和野生型BHK-21细胞（4.67,96 h）;弱毒株LaSota病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID₅₀（4.07,96 h）要高于BHK-21-chTIGAR细胞（3.90,96 h）和野生型BHK-21细胞（3.77,96 h）。综上所述,所构建的BHK-21-hamTIGAR细胞系具有明显的抗凋亡功能,且有利于新城疫病毒的高水平复制,有望进一步开发完善成为新城疫病毒疫苗生产所用的细胞株。     

BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒

为建立基于无血清悬浮培养细胞生产新城疫病毒(NDV)的工艺,本研究首先筛选了适于NDV增殖的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)单克隆细胞株,并将鸡胚适应的NDV在筛选获得的细胞株(BHK-v002)中传代,获得细胞适应的NDV。进一步采用单因素实验法检测病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度、细胞培养液的稀释比例等工艺参数对病毒效价的影响。结果显示,NDV在无血清培养的BHK-v002细胞中增殖的最适条件为:当细胞生长至约9.0×10^6个/mL时,以培养液.新鲜培养基为2:1的比例补加新鲜培养基,使细胞密度达6.0×10^6个/m L,按MOI为0.005接种NDV LaSota株,TPCK-胰酶终浓度为5μg/mL。接种病毒后96 h收获病毒液的HA效价为8.5 log2HAU/25μL,单细胞产毒量(Svy)达到1 685.9病毒颗粒/细胞,半数组织细胞感染剂量(TCID50)为7.9 log10TCID50/100μL。本研究确定了NDV LaSota株在BHK-21细胞悬浮培养中的增殖条件,建立了基于BHK-21细胞无血清悬浮培养体系中NDV的生产工艺,该工艺操作简便,易于放大,为当前ND疫苗的鸡胚生产工艺提供了候选替代方案。     

The Development and Application of the Latex Agglutination Test to Detect Serum Antibodies against Japanese Encephalitis Virus

The attenuated SA14-14-2 strain of Japanese encephalitis virus (JEV) was cultured in BHK-21 cells. The viral supernatant was purified and concentrated with PEG (MW 20 000). A suitable concentration of JEV antigen was used to sensitize latex to prepare the latex antigen. The specificity, sensitivity and stability of the antigen were assessed. A latex agglutination test (LAT) was developed for rapidly detecting antibody against JEV infection. The LAT and haemagglutination inhibition (HI) assay were compared by simultaneously testing 35 porcine serum samples from five farms. Ninety per cent (20/23) of the samples were seropositive by both assays. No significant difference was found between the two methods (p > 0.05). Furthermore, when 1613 porcine sera from 120 farms were tested by LAT, the number of positive sera was 652, while that of negative sera was 961, ranging from 20% to 50% positive throughout the year. These results indicate that LAT is an appropriate candidate method for epidemiological surveys for and diagnosis of Japanese encephalitis.     

共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定

为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。     

Comparative studies on the growth of Australian bluetongue virus serotypes in continuous cell lines and embryonated chicken eggs

The replication of cell culture passaged Australian bluetongue virus (BTV) isolates, serotypes 20 (CSIRO19) and 1 (CSIRO156), and an untyped BTV (CSIRO154) was assessed in eight continuous cell lines (one derived from baby hamster kidney cells, BHK-21; three derived from monkey kidney cells, Vero, LLC-MK2 and CV-1P; a foetal ovine lung and a mouse fibroblast cell line, CSL503 and L929, respectively, a Super-Vero-Porcine stable cell line, SVP; and a mosquito cell line, Aedes albopictus cells) and in 11-day-old embryonated chicken eggs (ECE) at different multiplicities of infection. All three viruses replicated in the cell lines tested, maximum extracellular virus yields being attained from BHK-21 cells at high multiplicities of infection (approximately 10 PFU per cell). Also BHK-21 cells produced much higher yields of virus than the other cell lines tested when low multiplicities of infection were used (approximately 10(-4) PFU per cell). All BTV serotypes multiplied in Singh's Aedes albopictus cells with no cytopathogenic effects over the 4 day period tested. The viruses also replicated in 11-day-old ECE; however, the sensitivity of ECE for growth of the Australian serotypes was not as high as has been reported for BTV isolates in other countries. In all cell culture systems and in ECE, BTV1 and BTV20 replicated more efficiently than did CSIRO154 virus.