H9N2亚型禽流感病毒纯化及病毒HA蛋白定量方法研究

为实现H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗上下游过程的控制,本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯度离心分别进行澄清、浓缩和分离纯化;其次,采用改装过的高效液相色谱仪系统(HPLC)准确定位和收集病毒离心区带,并对该区带进行SDS-PAGE和Western blotting分析,同时考察该收集方式的线性和重复性;然后,在此基础上优化病毒液的澄清工艺以提高病毒回收率;最后,观察还原SDS-PAGE分离的H9N2亚型AIV蛋白条带的共迁移情况并确定糖苷酶PNGase F脱糖基处理的最佳条件,采用Image J软件分析SDS-PAGE图谱中4个主要病毒蛋白条带(NP、HA1、M1和HA2)的灰度以确定流感病毒血凝素的含量。结果表明,HPLC收集的病毒离心区带的蛋白浓度与PEG6000浓缩的上清体积在8～32 mL范围内具有良好的线性关系(R~2=0.994),且该收集方式重复性好,批内和批间变异系数分别为1.29%和4.11%。病毒液经过澄清、浓缩和分离纯化后,最终的病毒回收率为79.55%。纯化的H9N2亚型AIV的蛋白浓度为1 000μg/mL时,经糖苷酶PNGase F脱糖基处理后便能得到条带清晰平整且分离良好的SDS-PAGE图谱。经灰度分析,HA含量占总病毒蛋白含量的46.18%。本研究初步建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法,为H9N2亚型AIV全病毒灭活疫苗的研发和生产提供了简单、准确的检测手段。     

体外培养方式对猪睾丸细胞代谢的影响

为了解猪睾丸细胞(ST)在体外培养过程中的代谢特点,对方瓶、转瓶和生物反应器培养环境中ST细胞的葡萄糖、乳酸及氨的代谢进行了考察。结果表明3种培养方式的ST细胞生长过程中的葡萄糖消耗、乳酸和氨的生成均主要发生在延滞期和对数生长期这2个阶段,与方瓶和转瓶培养比较,生物反应器系统培养ST细胞的葡萄糖利用率高,乳酸及氨的生成低,优于方瓶和转瓶的培养方式。反应器中前3天的葡萄糖比消耗速率约为5.67mmol(109cell.day)-1,乳酸比生成速率约为2.9mmol(109cell.day)-1,YLac/Gluc约为0.51mmol/mmol,所消耗葡萄糖的26%转化为乳酸。     

猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞中增殖规律的研究

通过孔板培养系统以及微载体和转瓶培养系统，研究了感染复数(MOI)、病毒感染时间(TOI)和病毒维持液对细胞生长和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)繁殖的影响。结果表明，MOI影响细胞生长速率和单位细胞病毒产量，TOI影响细胞对病毒的敏感程度以及胞内病毒的增殖速率；丰富的维生素、氨基酸等物质有利于病毒效价的提高；采用微载体和生物反应器系统生产TGEV，病毒效价可达11．3lgTCID50／0．2mL,北方瓶培养系统提高约100倍。     

猪瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中的表达和免疫原性分析

【目的】 设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性, 为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】 利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH, 将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒, 转导HEK293T细胞, 经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】 pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定, 得到大小分别为8 172 bp的载体片段和1 521 bp的E2-GM-CSF基因片段, 表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体; 细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1 686 bp的条带, 表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组; Western blotting分析获得约70 ku的条带, 证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达; SDS-PAGE验证显示, 纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带, 纯度较高, 大小约70 ku; 小鼠免疫血清ELISA检测结果表明, 表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性, 免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体, 免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900, 免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8 100, 远高于E2蛋白的1∶1 800。【结论】 利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白, 为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗, 同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。     

BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒

为建立基于无血清悬浮培养细胞生产新城疫病毒(NDV)的工艺,本研究首先筛选了适于NDV增殖的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)单克隆细胞株,并将鸡胚适应的NDV在筛选获得的细胞株(BHK-v002)中传代,获得细胞适应的NDV。进一步采用单因素实验法检测病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度、细胞培养液的稀释比例等工艺参数对病毒效价的影响。结果显示,NDV在无血清培养的BHK-v002细胞中增殖的最适条件为:当细胞生长至约9.0×10^6个/mL时,以培养液.新鲜培养基为2:1的比例补加新鲜培养基,使细胞密度达6.0×10^6个/m L,按MOI为0.005接种NDV LaSota株,TPCK-胰酶终浓度为5μg/mL。接种病毒后96 h收获病毒液的HA效价为8.5 log2HAU/25μL,单细胞产毒量(Svy)达到1 685.9病毒颗粒/细胞,半数组织细胞感染剂量(TCID50)为7.9 log10TCID50/100μL。本研究确定了NDV LaSota株在BHK-21细胞悬浮培养中的增殖条件,建立了基于BHK-21细胞无血清悬浮培养体系中NDV的生产工艺,该工艺操作简便,易于放大,为当前ND疫苗的鸡胚生产工艺提供了候选替代方案。     

H9N2亚型禽流感病毒纯化及病毒HA蛋白定量方法研究

为实现H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）疫苗上下游过程的控制，本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯度离心分别进行澄清、浓缩和分离纯化；其次，采用改装过的高效液相色谱仪系统（HPLC）准确定位和收集病毒离心区带，并对该区带进行SDS-PAGE和Western blotting分析，同时考察该收集方式的线性和重复性；然后，在此基础上优化病毒液的澄清工艺以提高病毒回收率；最后，观察还原SDS-PAGE分离的H9N2亚型AIV蛋白条带的共迁移情况并确定糖苷酶PNGase F脱糖基处理的最佳条件，采用Image J软件分析SDS-PAGE图谱中4个主要病毒蛋白条带（NP、HA1、M1和HA2）的灰度以确定流感病毒血凝素的含量。结果表明，HPLC收集的病毒离心区带的蛋白浓度与PEG6000浓缩的上清体积在8~32 mL范围内具有良好的线性关系（R²=0.994），且该收集方式重复性好，批内和批间变异系数分别为1.29%和4.11%。病毒液经过澄清、浓缩和分离纯化后，最终的病毒回收率为79.55%。纯化的H9N2亚型AIV的蛋白浓度为1 000 μg/mL时，经糖苷酶PNGase F脱糖基处理后便能得到条带清晰平整且分离良好的SDS-PAGE图谱。经灰度分析，HA含量占总病毒蛋白含量的46.18%。本研究初步建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法，为H9N2亚型AIV全病毒灭活疫苗的研发和生产提供了简单、准确的检测手段。     

应用生物反应器和微载体培养Vero细胞生产猪流行性腹泻病毒的研究

对应用生物反应器系统和微载体培养Vero细胞生产PEDV进行了实验研究,通过分析和比较批培养及换液培养过程中细胞生长、代谢和病毒增殖的相互关系,发现PEDV随着细胞的生长而不断在胞内增殖和积累,72h后Vero细胞需经过一个短暂的停止生长阶段,再继续呈指数生长。反应器换液培养的单位培养基细胞产量比批培养提高了28%,比方瓶培养提高了138%,疫苗生产效率显著提高。当接种密度为1 23×105cells/ml时,换液培养至96h时获得了1 74×106cells/ml的高细胞密度,细胞扩增了14 3倍,且单位细胞的病毒产量并不低于静态培养。     

培养基组分及操作参数对抗体多聚体形成的影响

近年来,国家食品药品监督管理局基于药物安全性的考虑对于治疗性蛋白的质量提出了更高的要求,而蛋白多聚体能引起人体免疫反应,被认为是关键质量属性(critical quality attributes,CQA)。采用培养基组分添加试验和操作参数控制试验的方法,系统研究了培养基中氧化还原物质和培养过程参数(温度和p H值)对抗体多聚体形成的影响。结果表明,半胱氨酸的添加能显著抑制多聚体的形成,培养基中半胱氨酸添加浓度增至30 mmol/L,多聚体含量下降40%。而铜离子的添加浓度从500μmol/L降至0μmol/L,多聚体含量则降低了43%。培养温度从35℃降低至32℃,重链结合蛋白(Bi P)和蛋白二硫键异构酶(PDI)的表达水平均提高了89%,细胞翻译后修饰能力显著加强,分泌至上清液中的抗体多聚体含量相应下降了38%。研究结果明确了生产工艺和产品关键属性之间的关系,为后续设计优化以质量为先导的培养过程,生产质量可控、安全、有效抗体药物奠定了基础。     

基于产品质量分析的中国仓鼠卵巢细胞流加培养工艺的优化

在前期建立的流加培养工艺的基础上，考察培养过程中的pH值对流加培养过程的影响，明确了过程控制参数pH值与产品关键质量属性（critical quality attributes，CQAs）间的联系，建立了产物质量属性和过程操作属性间的关系，并确认pH值为抗体融合蛋白生产工艺中的关键控制参数。结果表明，流加培养过程随着培养pH值的提高，抗体融合蛋白的生物学活性呈一定程度的下降趋势，但唾液酸含量却呈明显的上升趋势；此外，在pH值6．9和pH值7．0的条件下培养过程中的最大细胞密度、活力、蛋白表达量均优于其他条件，确定6．95±0．05为过程的控制pH值。将此培养工艺放到大200 L中试生产规模，结果与2 L反应器的结果基本一致。     

无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响

【目的】 建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗的工艺，提高PCV2疫苗生产效率，降低PCV2疫苗生产成本。【方法】 首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化，并在无血清悬浮培养体系下，采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数（MOI）（0.10、0.05、0.01和0.001）和不同PK-15细胞接种密度（CDI）（1.0×10⁶、3.0×10⁶、5.0×10⁶/mL）对PCV2增殖的影响，同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】 贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养，且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^-1增加到0.6 d^-1；悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代，连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^-1附近波动，且细胞活率始终>90%；以1.0×10⁶/mL接种，第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10⁶/mL，并可维持1 d，第4天前活率均>90%，此后快速下降；病毒增殖最佳工艺参数为：感染复数为0.05，细胞接种密度为1.0×10⁶/mL，最终收获时病毒滴度可达10^6.2TCID₅₀/mL；对细胞感染前后的代谢分析发现，病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前，且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累，之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】 30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株，PK-15细胞可用于PCV2增殖，结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。