Marc-145细胞的无血清悬浮培养基开发

为开发适合Marc-145细胞生长的无血清悬浮培养基,试验将贴壁Marc-145细胞转入Celer-S001培养基中进行悬浮适应,通过混料试验和水解物筛选试验获得适应Marc-145细胞快速扩增的无血清悬浮培养基,对悬浮培养的Marc-145细胞进行猪繁殖与呼吸综合征病毒感染并检测病毒效含量,评价悬浮培养的Marc-145细胞的病毒扩增能力。结果表明：Marc-145细胞可以在Celer-S001培养基中悬浮培养,其比生长速率为(0.25±0.06)/d;适应Marc-145细胞快速扩增的最优无血清悬浮培养基由B3和B8培养基以0.54∶0.46比例混合,并添加2 g/L的水解物H3构成,Marc-145细胞的比生长速率为(0.51±0.03)/d,密度为3.73×10⁶ cells/mL;细胞接毒后的病毒含量最高可达(5.25±0.25)lgTCID₅₀/mL,表明细胞仍然保持着病毒扩增能力。说明试验成功开发了适合Marc-145细胞生长的无血清悬浮培养基,Marc-145细胞在该培养基中生长良好,具有病毒扩增能力。     

检测水貂出血性肺炎绿脓杆菌的比色LAMP法的建立与应用

为了快速有效检测水貂出血性肺炎病原绿脓杆菌,本研究结合金属指示剂HNB特性建立了快速检测绿脓杆菌比色LAMP法。根据绿脓杆菌外毒素A基因设计引物,建立了检测LAMP法;并且对该方法进行了特异性、灵敏性分析;同时进行了初步应用。结果显示,该方法特异性强,灵敏性好,可检测167CFU/mL的菌体,对病貂肺脏检出率高。结果表明,该比色LAMP法可以有效地检测水貂出血性肺炎绿脓杆菌。     

H9N2亚型禽流感病毒纯化及病毒HA蛋白定量方法研究

为实现H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗上下游过程的控制,本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯度离心分别进行澄清、浓缩和分离纯化;其次,采用改装过的高效液相色谱仪系统(HPLC)准确定位和收集病毒离心区带,并对该区带进行SDS-PAGE和Western blotting分析,同时考察该收集方式的线性和重复性;然后,在此基础上优化病毒液的澄清工艺以提高病毒回收率;最后,观察还原SDS-PAGE分离的H9N2亚型AIV蛋白条带的共迁移情况并确定糖苷酶PNGase F脱糖基处理的最佳条件,采用Image J软件分析SDS-PAGE图谱中4个主要病毒蛋白条带(NP、HA1、M1和HA2)的灰度以确定流感病毒血凝素的含量。结果表明,HPLC收集的病毒离心区带的蛋白浓度与PEG6000浓缩的上清体积在8～32 mL范围内具有良好的线性关系(R~2=0.994),且该收集方式重复性好,批内和批间变异系数分别为1.29%和4.11%。病毒液经过澄清、浓缩和分离纯化后,最终的病毒回收率为79.55%。纯化的H9N2亚型AIV的蛋白浓度为1 000μg/mL时,经糖苷酶PNGase F脱糖基处理后便能得到条带清晰平整且分离良好的SDS-PAGE图谱。经灰度分析,HA含量占总病毒蛋白含量的46.18%。本研究初步建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法,为H9N2亚型AIV全病毒灭活疫苗的研发和生产提供了简单、准确的检测手段。     

乐昌市野生观赏植物资源及其利用

据调查,乐昌市有野生观赏植物资源173科496属1 205种,其中蕨类28科47属139种,裸子植物8科13属18种,被子植物137科436属1 048种。本文分析了乐昌市野生观赏植物资源的基本特性和主要应用类型,并对资源保护和开发利用提出建议,以期为开发利用乡土野生观赏植物资源提供参考。     

无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响

【目的】 建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗的工艺,提高PCV2疫苗生产效率,降低PCV2疫苗生产成本。【方法】 首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化,并在无血清悬浮培养体系下,采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数（MOI）（0.10、0.05、0.01和0.001）和不同PK-15细胞接种密度（CDI）（1.0×10⁶、3.0×10⁶、5.0×10⁶/mL）对PCV2增殖的影响,同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】 贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养,且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^-1增加到0.6 d^-1;悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代,连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^-1附近波动,且细胞活率始终>90%;以1.0×10⁶/mL接种,第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10⁶/mL,并可维持1 d,第4天前活率均>90%,此后快速下降;病毒增殖最佳工艺参数为：感染复数为0.05,细胞接种密度为1.0×10⁶/mL,最终收获时病毒滴度可达10^6.2TCID₅₀/mL;对细胞感染前后的代谢分析发现,病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前,且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累,之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】 30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株,PK-15细胞可用于PCV2增殖,结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。     

猪瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中的表达和免疫原性分析

【目的】 设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性, 为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】 利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH, 将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒, 转导HEK293T细胞, 经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】 pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定, 得到大小分别为8 172 bp的载体片段和1 521 bp的E2-GM-CSF基因片段, 表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体; 细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1 686 bp的条带, 表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组; Western blotting分析获得约70 ku的条带, 证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达; SDS-PAGE验证显示, 纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带, 纯度较高, 大小约70 ku; 小鼠免疫血清ELISA检测结果表明, 表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性, 免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体, 免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900, 免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8 100, 远高于E2蛋白的1∶1 800。【结论】 利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白, 为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗, 同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。     

论小麦高产播种技术措施

一、选种．①风选,就是利用自然风力选种,去除夹杂在种子中的杂质、秕粒和病虫粒,但风选还达不到完全净化和除秕的目的。②筛选,是在风选的基础上,选择筛孔合适的筛子（筛孔直径在2．5～2．8毫米为宜）,筛除小粒、秕粒和夹杂物,选留大而饱满的籽粒做种。     

水貂出血性肺炎二价灭活疫苗的候选株评价及疫苗制备

为了获得针对水貂出血性肺炎的特异性疫苗,试验从分离自2012年水貂出血性肺炎病例的24株绿脓杆菌中筛选出血清G型(D4株)与血清C型(C1株)各1株;同时研制血清G型、血清C型及血清G-C型二价灭活疫苗,分别免疫小鼠与水貂,攻病原菌,测定疫苗的保护率、血清抗体消长规律。结果表明:分离株D4与C1在30代内菌体含量稳定,D4株在24代内毒力稳定,C1株在21代内毒力稳定;血清G型与C型单价疫苗都可对50倍LD50本型病原菌产生完全保护,二价灭活疫苗可对50倍LD50血清G型与C型病原菌完全保护。一免后第21天小鼠血清抗体水平达到峰值,抗G型与C型菌中和抗体效价为1∶3 200,1∶6 400,在35 d后抗体水平下降;二免后,水貂55 d内血清中和抗体维持在较高水平。说明D4株与C1株可以作为良好的水貂出血性肺炎疫苗的候选株,制备的二价灭活疫苗能对水貂产生良好保护力,为水貂出血性肺炎防治奠定坚实基础。     

一起水貂出血性肺炎的诊断与治疗

水貂出血性肺炎主要是由铜绿假单孢菌（又称绿脓杆菌）引起的一种急性传染病,该病多发生于温暖潮湿的季节,常呈地方性暴发流行,以出血性肺炎和败血症为主要特征。2012年7月份,山东省临近沿海某地区多家水貂养殖场相继出现了水貂出血性肺炎,造成了巨大的经济损失。     

森林生态系统管理概述

生态系统管理起源于传统的林业资源管理,是随着生态学的迅速发展和人类对生存环境破坏与资源利用认识的不断加深而逐渐形成的.特别是1992年联合国召开环境与发展会议以来,可持续发展成为国际社会的共识.生态系统是人类生存和发展的基础,人类社会的可持续发展归根结底是生态系统管理问题.森林是陆地上面积最大、生产力和生物量最高、生物多样性最丰富的自然生态系统,它在涵养水源、净化空气等方面具有重大作用.在人类社会发展过程中,森林孕育了人类、促进了社会经济的发展,是人类生存和发展的摇篮.因此,森林生态系统管理是生态系统管理的主要内容之一,是21世纪林业科学的主线和森林经营管理的核心,是各国林业可持续发展的重要方向.实施森林生态系统管理对缓解我国森林资源的供需矛盾、防止地力退化和病虫害的发生、改善生态环境及实现我国林业的可持续发展都具有十分重要的意义.