H9N2亚型禽流感病毒纯化及病毒HA蛋白定量方法研究

为实现H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）疫苗上下游过程的控制，本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯度离心分别进行澄清、浓缩和分离纯化；其次，采用改装过的高效液相色谱仪系统（HPLC）准确定位和收集病毒离心区带，并对该区带进行SDS-PAGE和Western blotting分析，同时考察该收集方式的线性和重复性；然后，在此基础上优化病毒液的澄清工艺以提高病毒回收率；最后，观察还原SDS-PAGE分离的H9N2亚型AIV蛋白条带的共迁移情况并确定糖苷酶PNGase F脱糖基处理的最佳条件，采用Image J软件分析SDS-PAGE图谱中4个主要病毒蛋白条带（NP、HA1、M1和HA2）的灰度以确定流感病毒血凝素的含量。结果表明，HPLC收集的病毒离心区带的蛋白浓度与PEG6000浓缩的上清体积在8~32 mL范围内具有良好的线性关系（R²=0.994），且该收集方式重复性好，批内和批间变异系数分别为1.29%和4.11%。病毒液经过澄清、浓缩和分离纯化后，最终的病毒回收率为79.55%。纯化的H9N2亚型AIV的蛋白浓度为1 000 μg/mL时，经糖苷酶PNGase F脱糖基处理后便能得到条带清晰平整且分离良好的SDS-PAGE图谱。经灰度分析，HA含量占总病毒蛋白含量的46.18%。本研究初步建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法，为H9N2亚型AIV全病毒灭活疫苗的研发和生产提供了简单、准确的检测手段。     

禽流感病毒H9和N2亚型双重RT-PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,根据AIV H9亚型和N2亚型基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了H9亚型和N2亚型AIV双重RT-PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT-PCR扩增,可得到545bp H9基因特异性条带和341bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。结果表明该双重RT-PCR最低能检出100fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。     

禽流感病毒 H9和 N2基因双重 RT-PCR 方法的建立

为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒（AIV ）的方法,根据AIV H9和N2基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了 H9亚型和N2亚型AIV双重RT‐PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT‐PCR扩增,可得到545 bp H9基因条带和341 bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341 bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性;结果表明该双重RT‐PCR最低能检出100 fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV) HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定.结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长.单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞.研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现.S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用.这提示该病的防控面临着新的挑战.     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

H3N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒(AIV)且同时区分H3N2亚型AIV的方法,本研究根据H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT-PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518bp为AIV M基因、418bp为N2亚型AIV NA基因、271bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518bp、271bp和518bp、418bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对H3N2亚型AIV的检测下限为100pg,96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。     

H7N9亚型禽流感病毒HA基因mRNA的构建

H7N9亚型禽流感病毒(AIV)持续给家禽及人类健康造成威胁。为构建H7N9亚型AIV (简称H7N9AIV) mRNA疫苗，本研究以AIV分离株A/chicken/Yunnan/SD024/2021 (H7N9)(简称CK/YN/SD024/2021)的HA基因为目的基因、选择来自人β-球蛋白和非洲爪蟾β-球蛋白的不同编码基因序列作为HA基因的非翻译区(UTR)，构建了中间转录质粒p GEM-YN和p XT7-YN，以2个质粒为模板通过体外转录制备了mRNA m H7-YN-p GEM和m H7-YN-p XT7；将2种mRNA转染HEK293T细胞，western blot鉴定结果显示2种mRNA转染的细胞均可检测到约为70 ku的HA蛋白条带和50 ku的HA1蛋白条带；通过间接免疫荧光试验(IFA)确定最适转染剂量和HEK293T细胞中HA蛋白的动态表达，结果显示，3μg mRNA转染106个细胞并于转染24 h后荧光信号强度均最强；将2种mRNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，均可通过IFA检测到HA蛋白的表达。以上结果表明，本研究正确构建了2种含H7N9 AIV HA基因的m...     

禽流感病毒 H3N2亚型三重 RT-PCR 检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒（AIV ）且同时区分 H3N2亚型AIV 的方法,本研究根据 H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M 基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT‐PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518 bp为AIV M 基因、418 bp为N2亚型AIV NA基因、271 bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518 bp、271 bp和518 bp、418 bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518 bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对 H3N2亚型AIV的检测下限为100 pg ;96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。     

广州市活禽市场7株H9N2亚型禽流感病毒全基因进化分析

为了解广州市活禽交易市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异特点和流行情况,本研究对2015年5月~2016年6月分离的7株H9N2亚型AIV进行全基因组的遗传进化分析。结果显示,7株H9N2亚型AIV均属于G57基因型,其中有4株分离株的部分内部基因与人源H7N9亚型病毒株基因的核苷酸同源性在99%以上。HA裂解位点未发现碱性氨基酸的替换,HA潜在糖基化位点存在添加或缺失现象,HA蛋白aa155位和aa226位分别为苏氨酸(T)和亮氨酸(L),具有结合人流感病毒受体能力。NA蛋白颈部存在氨基酸缺失,M1蛋白N~(30)D、T~(139)A、T~(215)A,NS1蛋白P~(42)S等突变可能会增加病毒的致病性。结果表明广州市活禽交易市场H9N2亚型AIV的基因型趋于稳定,但其糖基化位点和受体结合位点等呈现多样化,并且H9N2亚型AIV的内部基因能够为其它亚型AIV提供内部片段,其对养殖行业及人类健康产生潜在威胁,仍需对其进行持续的监测。     

2011年中国北方H9N2亚型禽流感病毒分离株HA基因进化分析及受体结合性检测

为了解近期中国北方禽源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)流行规律及分子遗传进化特征,本实验对2011年在中国北方家禽中分离到的11株H9N2亚型AIV通过RT-PCR扩增病毒的HA基因片段,进行测序及遗传进化分析,并对这些病毒的受体结合性进行了检测.结果表明:11株H9N2亚型AIV分离株的HA基因在HA1和HA2的氨基酸裂解位点均为PSRSSR/GLF基序,符合低致病性病毒株氨基酸序列特征.多数病毒HA潜在糖基化位点为8个,所有分离株病毒的受体结合位点226位均为L,经红细胞受体结合性试验验证表明这些病毒均同时具有α-2,3和α-2,6受体结合特性,表明目前北方地区流行的H9N2亚型AIV具有感染哺乳动物的潜在威胁.本研究结果对加强H9N2病毒的分子流行病学监测具有重要意义.     

波形蛋白对H9N2亚型AIV复制的影响研究

为研究波形蛋白(vimentin)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,构建了真核表达载体FLAG-vimentin,并采用Western blot技术验证FLAG-vimentin重组载体和病毒NP蛋白的表达情况,用荧光定量PCR技术检测病毒HA基因水平。同时,设计合成siRNA,敲低内源性vimentin,检测其对病毒HA基因表达水平的影响。构建原核表达载pCold I-vimentin,蛋白纯化后孵育细胞,采用Western blot、荧光定量PCR技术检测病毒的蛋白表达和基因水平的变化。结果证实,H9N2亚型AIV感染FLAG-vimentin重组载体转染的Hela细胞12 h时,病毒NP蛋白表达减少;而在感染24和36 h时,病毒NP蛋白表达上升。荧光定量PCR结果亦显示,在AIV感染后12 h时,HA基因表达水平明显降低。siRNA敲低Hela细胞内源性vimentin后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12 h时明显升高,24 h时差异较小,36 h时有所升高。纯化后的vimentin重组蛋白孵育细胞,在病毒感染36 h时,H9N2亚型AIV的NP蛋...     

H6N1亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)HA、NA基因,分别设计并筛选出2对特异性引物,用于H6亚型AIV和N1亚型AIV的检测,优化反应条件,建立了H6N1亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。对该法进行特异性、敏感性检验,并用该法对临床样品进行检测。所建立的方法对H6N1亚型AIV可特异性扩增出447 bp(H6亚型)和325 bp(N1亚型)目的条带,对H6Ny亚型AIV仅扩增出447 bp目的条带,对HXN1亚型AIV仅扩增出325 bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带;该法对H6N1亚型AIV检测下限为5×102拷贝/μL;341份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。本研究所建立的H6N1亚型AIV RT-PCR特异性强、灵敏度高,一管可同时检测H6和N1亚型AIV,为H6N1亚型AIV的检测提供一种简便、快速和有效的检测方法。     

H10亚型和N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中H10亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N8亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因序列,分别设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,建立了H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法。该法对含有H10和N8亚型AIV的模板可特异性扩增出267 bp(H10亚型AIV)、464 bp(N8亚型AIV)和693 bp(AIV)目的条带,对H10亚型AIV扩增出267、693 bp目的条带,对N8亚型AIV扩增出464、693 bp目的条带,对其他亚型AIV仅扩增出693 bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限为10~3拷贝/μL。120份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。研究建立的H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为同时快速鉴别检测H10亚型和N8亚型AIV提供一种简便、快速和有效的方法。     

H6N1亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、N1亚型AIV的NA基因和所有亚型AIV的M基因序列,分别设计并筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,建立了H6N1亚型AIV三重RT-PCR检测方法。对该法进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果显示,所建立的方法对H6N1亚型AIV可特异性扩增出447(H6亚型AIV)、325(N1亚型AIV)和669bp(AIV)目的条带,对H6亚型AIV扩增出447、669bp目的条带,对N1亚型AIV扩增出325、669bp目的条带,对其他亚型AIV仅扩增出669bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带;该法对H6N1亚型AIV检测下限为0.1pg;305份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。本研究所建立的H6N1亚型AIV三重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可同时快速鉴别检测H6、N1亚型AIV和所有亚型AIV,为H6N1亚型AIV的检测提供1种简便、快速和有效的方法。     

2株鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒HA基因序列分析

为了探究2株鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)HA基因的遗传进化关系,分别对2株鹌鹑源H9N2亚型AIV的HA基因进行了序列测定及遗传进化分析。结果显示,2株鹌鹑H9N2亚型AIV的HA基因核苷酸同源性为97.7%,与参考毒株A/Quail/wuxi/7/2010(H9N2)相比,分别为97.7%、97.0%,均属于h9.4.2进化分支(Y280-like亚群);其推导氨基酸裂解位点均为PSRSSR↓GL,属于低致病性AIV;均存在8个相同的潜在糖基化位点,第313位的糖基化位点正好位于HA蛋白裂解位点附近,可能影响HA的裂解,改变AIV的毒力;受体结合位点第234位均为L,具有结合哺乳动物唾液酸α-2,6受体的特征。结果表明,2株鹌鹑H9N2亚型AIV均为低致病性AIV,但具有感染人的特征,其HA基因均属于大陆H9N2亚型AIV流行谱系的h9.4.2分支。     

H9N2亚型禽流感病毒糖基化位点突变株的构建与生物学特性研究

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白第200位N-糖基化位点的功能,利用流感病毒8质粒反向遗传系统拯救出重组病毒r-WZP株(缺失HA基因第200位N-糖基化位点)和r-WZP200株(含有HA基因第200位N-糖基化位点)。两株病毒的内部基因来自病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1),HA基因与NA基因均来自H9N2AIV流行毒株。结果表明,两株病毒均能够在SPF鸡胚中稳定增殖,这一位点的缺失致使病毒与鸡红细胞的结合能力下降,HA效价热稳定性提高,对SPF鸡胚的致死能力增强,对进一步研究H9N2亚型AIV HA蛋白N-糖基化位点的功能具有重要的参考价值。     

12株H9N2亚型禽流感病毒与Sia-α-2,6-唾液酸受体结合力的变化研究

为分析H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)对Sia-α-2,6-唾液酸受体(Sia-α-2,6-Gal)结合力的变化趋势,选择2001~2013年分离自山东省的12株H9N2 AIV进行研究。利用同源建模、分子动力学和分子对接等计算方法,对12株H9N2 AIV的HA蛋白与Sia-α-2,6-Gal之间相互作用进行系统研究,筛选HA蛋白中与Sia-α-2,6-Gal结合的关键氨基酸,并对关键氨基酸进行饱和突变研究。结果显示:随着分离年代临近,H9N2 AIV对Sia-α-2,6-Gal亲和能力有增强趋势,Thr198、Leu234、Met235位点的某种氨基酸突变能够大幅提高HA蛋白与Sia-α-2,6-Gal的结合能力。推测H9N2 AIV对哺乳动物感染能力呈逐渐增强趋。     

H9N2亚型禽流感病毒HA基因的表达及其单因子血清的制备

为了制备特异性识别H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的单因子血清,本试验提取H9N2亚型AIV RNA,RT-PCR后,分别扩增上段HA1、中段HA2和下段HA33段基因。将他们插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(Rosetta)菌株中表达。将表达的蛋白常规免疫昆明白小鼠,以制备抗血清。结果显示,成功获得3段重组融合蛋白,且均具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,上段HA1、中段HA2制备的单因子血清均可与H9N2亚型AIV反应,而下段HA3则不能。重组马立克氏病病毒(MDV)MZC12 HA/NA同样证明HA1、HA2两段制备的单因子血清能识别HA基因的表达。本试验成功制备了识别H9N2亚型AIV HA的单因子血清,为H9N2亚型AIV的鉴别诊断及研究奠定了基础。     

对麻鸭不同致病力H5N1亚型禽流感病毒的鉴定

禽流感病毒（avain influenza virus,AIV）根据其HA和NA蛋白分为不同亚型,目前16种HA亚型和9种NA亚型均已从水禽中分离到。2002年之前的研究表明,H5N1亚型AIV对水禽不致病,在宿主体内呈相对稳定的“静止”状态进化。自2002年香港首次出现大量野生水禽和家养水禽感染H5N1亚型AIV后,相关报道越来越多。以上均提示,高致病性H5N1亚型AIV对水禽的致病力已经明显增强。