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1.
本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒102.63 TCID50/100 μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰ H2O2的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50 μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1:3 200的HI=2-9标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。 相似文献
2.
为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,并利用Ni柱进行纯化,应用Western blot、Dot blot、ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定。同时将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行了反应性测定、效价测定及亚型鉴定。结果显示,PRV gE蛋白在毕赤酵母中成功表达,并获得了纯化蛋白,纯度达90%以上,且具有良好的生物学活性,与PRV阳性血清反应性良好;筛选到4株敏感性强、特异性良好的gE单克隆抗体,均可同时特异识别PRV gE蛋白及病毒,分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3。综上,用酵母系统成功表达了PRV gE蛋白,并筛选到4株针对PRV gE蛋白的单克隆抗体。 相似文献
3.
为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)的单克隆抗体,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)GP5重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和NS0浆细胞瘤细胞进行融合,经间接ELISA和阻断ELISA筛选、有限稀释法克隆化获得3株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的(mAb)杂交瘤细胞株,命名为4B7、2C5和2E4。间接免疫荧光(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)结果显示,3株mAb均与感染PRRSV BJ 4株的Marc 145细胞特异性反应,表明其可识别天然病毒蛋白。mAb的Ig亚类均为IgG1,细胞培养上清和腹水的ELISA效价分别为1∶256和1∶51 200,Western blot分析表明,mAb均特异性识别PRRSV GP5蛋白。 相似文献
4.
采用辛酸一硫酸铵盐析和SuperdexTM-200 凝胶层析分离纯化猪血清IgG,免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术获得8株稳定分泌抗猪IgG 单克隆抗体的杂交瘤细胞.Ig 亚类分析表明,所制备单克隆抗体的轻链亚类均为K,重链除6H3为IgG2b外,其余7株均属于IgG1.Western blot分析显示,5株单克隆抗体识别猪IgG轻链,3株单克隆抗体识别猪IgG重链.以蛋白G亲和层析纯化单克隆抗体7H1腹水,用改良过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,结果显示,HRP 标记抗猪IgG单克隆抗体对纯化猪IgG的工作浓度达1:12 800.将HRP标记鼠抗猪IgG单克隆抗体与HRP标记羊抗猪IgG多克隆抗体应用于猪血清圆环病毒抗体检测,二者符合率为95.12%,其ELISA和Westem blot的工作浓度为1:2 000和1:10000,表明HRP标记抗猪IgG单克隆抗体具有高度的敏感性.本研究制备的酶标抗猪IgG单克隆抗体为猪病的免疫诊断试剂研究和猪细胞生物学研究提供了一种基础工具. 相似文献
5.
选择体重相近的长大二元猪68头,随机分为2组.试验结果表明:生物免疫饲料组与对照组相比日增重提高10.52%,料重比降低6.37%,腹泻率和腹泻指数分别降低75.45%、70.13%,粪中乳酸杆茵数量提高3.01%;并且猪皮红毛亮,色泽自然,体型好. 相似文献
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从牛肺巨噬细胞cDNA文库中扩增编码牛IgGFc受体Ⅱ(boFcγRⅡ)胞外区基因,PCR产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体pET28a的T7启动子下游,构建重组表达质粒pETboRⅡ。以pETboRⅡ转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析诱导表达菌体可见分子量约为27kDa的蛋白条带,该表达蛋白在细胞质中主要以不溶性包涵体形式存在。Westernblotting和Dotblot检测表明,boFcγRⅡ重组蛋白在变性条件下可与牛IgG特异结合,提示牛FcγRⅡ胞外区可能存在IgG线性结合表位。 相似文献
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将传染性支气管炎病毒(IBV)ZJ971 S1基因亚克隆到绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pEGFP—C2中,成功构建重组表达质粒pEGFP—ZJ971-S1。重组质粒在脂质体的介导下转染Vero细胞,借助荧光显微镜在转染后4h观察到S1—GFP融合蛋白的瞬时表达。免疫细胞化学染色(ICC)结果显示,抗ZJ971 S1D蛋白单克隆抗体和鸡抗IBVZJ971全病毒血清特异性识别了S1基因转染细胞,表明S1蛋白在Vero细胞中得到有效表达。荧光显微镜观察和ICC均表明,S1表达蛋白主要分布在转染细胞的胞浆内,而胞核中未见分布,提示IBVS1蛋白内可能存在与病毒装配相关的细胞定位信号。 相似文献
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为了得到一种能够高通量检测细胞培养物的方法,并将其用于筛选特异性强、敏感度高的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体。用每孔能感染约100个细胞的病毒量接种单层覆盖96孔板的Marc-145细胞,12 h后用含3%H_2O_2的甲醇固定细胞,以制备免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)反应板。以100μL/孔的量将融合后继续培养10 d的杂交瘤细胞的培养上清加入至IPMA反应板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,以3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作为显色底物,于倒置显微镜下进行观察。结果表明,共筛选出1D1、7G8等39份PRRSV单克隆抗体,这39份单抗能够使PRRSV中高致病毒株HN07-1和经典毒株BJ-4感染的Marc-145细胞被特异性染色,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒感染的Marc-145细胞无交叉染色。因此,构建的IPMA方法能够敏感、准确地捕捉到PRRSV单克隆抗体。 相似文献
10.
为建立H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10-4至2.56×10-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验(HI)显示血凝抑制活性,其(HI)效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验(HA)相当,与其他亚型AIV (H1、H3、H5、H7),以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。 相似文献