H9N2 AIV HA蛋白S145N变异毒株的抗原性和免疫原性

在研究1998-2008年中国H9N2亚型禽流感病毒（AIV）分离株HA基因的进化时,发现在25个毒株中有2个致病性最强的毒株因HA基因第145位氨基酸的突变导致产生1个潜在的糖基化位点,从而使其不与单抗H6、F6等反应。为进一步探究这类变异毒株HA基因变异对H9亚型AIV的抗原性和免疫原性的影响,本试验对12株HA蛋白S145N变异的H9N2AIV进行了交叉中和试验和交叉攻毒试验。结果显示,不同H9N2S145N变异株与疫苗株间在抗原性上变化不大,或无显著差异（0.5≤R≤0.67）。但参照现有的H9灭活疫苗效力检验方法对HP疫苗免疫鸡进行攻毒,用HP株攻毒对照组0/5保护,免疫组保护≥9/10,达到了H9灭活疫苗质量标准要求;但用S145N变异株N3攻毒,仅保护2/10～6/10,且随免疫量剂量的增加,抗体水平的提高,攻毒保护也依次升高。对H9变异株疫苗（N1、N2、N3、N8）免疫鸡用N3攻毒,仅保护2/5～4/5,N3同源抗体也不能有效地阻止其攻毒后的排毒。用N3、N6 2个变异株交叉攻毒,采用与疫苗株攻毒相同的剂量作攻毒试验也得到类似结果。表明高于6log2的抗体能抵抗疫苗株和大多数流行毒株攻毒后的排毒,但不能抵抗S145N变异株攻毒后的排毒。这类毒株免疫原性上的变化与病毒HA基因的变异密切相关。因HA基因145～147aa位增加了1个NGT,导致三维空间构象的变化,并影响其邻近的受体结合位点,从而使这类毒株致病性提高,免原性发生改变。虽然这一类变异株或免疫逃逸毒株仅占当前流行毒株总数的5%～7%,但在强大的免疫压力和自然选择下有可能逐步成为优势毒株,造成更大的危害,这为该病的防控提出了新的挑战。     

H9N2亚型禽流感病毒糖基化位点突变株的构建与生物学特性研究

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白第200位N-糖基化位点的功能,利用流感病毒8质粒反向遗传系统拯救出重组病毒r-WZP株(缺失HA基因第200位N-糖基化位点)和r-WZP200株(含有HA基因第200位N-糖基化位点)。两株病毒的内部基因来自病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1),HA基因与NA基因均来自H9N2AIV流行毒株。结果表明,两株病毒均能够在SPF鸡胚中稳定增殖,这一位点的缺失致使病毒与鸡红细胞的结合能力下降,HA效价热稳定性提高,对SPF鸡胚的致死能力增强,对进一步研究H9N2亚型AIV HA蛋白N-糖基化位点的功能具有重要的参考价值。     

我国H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白145和153位抗原位点变异分析

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)易发生抗原漂移,但识别我国H9N2亚型AIV流行株抗原差异性的关键抗原位点还不清楚.选取两株血凝抑制(HI)效价高的H9N2亚型AIV单克隆抗体2E4与2D6对A/Chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)毒株施加抗体压力制备单抗逃逸突变株,鉴定抗原位点...     

Clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感疫苗候选株的构建

2015年秋季以来,clade2.3.4.4的H5N2亚型禽流感病毒(AIV)分离率逐渐增加,成为我国华东地区流行的优势毒株。经遗传进化分析发现,与抗原性相关的血凝素(HA)氨基酸呈现出一定规律的进化趋势,导致抗原性发生变化。研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)AIV为内部基因供体,以clade2.3.4.4中的H5N2亚型毒株A/chicken/Yangzhou/YZ1111/2015(YZ1111)的表面抗原HA和神经氨酸酶(NA)为外部基因供体,并删除YZ1111株HA基因中编码多碱性氨基酸的序列,通过反向遗传操作,成功拯救出1株重组病毒r YZ1111。r YZ1111在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖性能,对SPF鸡胚和鸡均无致病性。表明在分析H5N2亚型AIV抗原变异的基础上研发出疫苗候选株,为防控变异的clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感提供了备选疫苗。     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。     

H9N2亚型禽流感病毒细胞高产株的拯救

为构建能够在MDCK细胞中高水平复制的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗株,本研究在对病毒生长特性及HA基因遗传进化分析的基础上,筛选出一株细胞高度适应的国内流行株A/chicken/Shanghai/11/2011(H9N2) (SH11),并通过反向遗传操作技术拯救出全部基因均来自亲本株的AIV rSH11株.生物学试验结果表明rSH11在鸡胚半数感染量(EID50)、组织培养半数感染量(TCID50)、遗传稳定性等方面均与亲本株保持一致,rSH11经MDCK细胞连续传5代后血凝价稳定在1∶1024,表明该病毒株具有细胞高度增殖的特性.采用rSH11株制备油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡,免疫一周即可以检测出HI抗体,免疫3周后HI抗体平均效价高于1∶700,表明其具有良好的免疫原性.rSH11疫苗对不同的H9N2病毒株能够产生良好的免疫保护作用,显著抑制免疫鸡排毒.H9N2亚型AIV细胞高产株的拯救为该亚型AIV细胞苗的研制奠定了基础.     

二株鸭源H11N9亚型禽流感病毒的遗传进化及致病性分析

为了解从湖南省洞庭湖区鸭群中分离的2株H11N9亚型禽流感病毒变异特点、进化规律及生物学特性,本研究对2株H11N9亚型禽流感病毒的HA、NA序列进行同源性和遗传进化分析,并用2株毒株对SPF鸡进行致病性试验。结果显示,本试验分离到2株H11N9亚型禽流感毒株的HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性毒株;HA基因的受体结合位点均非常保守,具有典型的禽源性特征;NA基因序列与在周边国家野鸟中分离的H11N9亚型毒株的氨基酸同源性较高;鼻腔接种SPF鸡后,均能使鸡感染并通过喉头或泄殖腔排毒,但感染的鸡均不表现明显的临床症状,并且不能使同居鸡感染排毒。     

2株鸭源 H11N9亚型禽流感病毒的基因遗传进化及致病性分析

为了解从湖南省洞庭湖区鸭群中分离的2株 H11N9亚型禽流感病毒变异特点、进化规律及生物学特性,本研究对2株H11N9亚型禽流感病毒的HA、NA序列进行同源性和遗传进化分析,并用2株毒株对SPF鸡进行致病性试验。结果显示,本试验分离到2株 H11N9亚型禽流感毒株的 HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性毒株;HA基因的受体结合位点均非常保守,具有典型的禽源性特征;NA基因序列与在周边国家野鸟中分离的H11N9亚型毒株的氨基酸同源性较高;鼻腔接种SPF鸡后,均能使鸡感染并通过喉头或泄殖腔排毒,但感染的鸡均不表现明显的临床症状,并且不能使同居鸡感染排毒。     

H9N2亚型禽流感疫苗株的筛选及其免疫效果评价

通过交叉血凝试验,疫苗备用毒株免疫SPF鸡后再用同源和异源毒株攻毒,评价疫苗备用毒株对SPF鸡保护效果。结果显示,H9N2疫苗备用株免疫SPF鸡后,再用H9亚型流感病毒流行株攻毒,SPF鸡咽喉和泄殖腔排毒量大大降低。结果表明,本试验筛选的疫苗备用毒株对H9N2亚型流感病毒具有一定的保护率,完全符合疫苗株要求。     

2007年～2010年H9N2亚型禽流感病毒分离株对SPF鸡的致病特性研究

本研究对2007年～2010年我国H9N2亚型禽流感病毒分离株的鸡胚平均死亡时间(MDT)进行分析,发现自2008年下半年来分离的H9N2亚型禽流感病毒对鸡胚的致病性有增强的趋势,在此基础上,选择MDT在60.5～96.3 h之间的9株病毒,比较其对SPF鸡的致病力.结果表明,对鸡胚致病性强的毒株,对SPF鸡的致病性也较强,能引起气管、肺、十二指肠、肾和脑等多器官的系统性感染,而且病毒在各组织器官的复制能力与致病性呈正相关.在感染SPF鸡后,所有毒株均呈现不同程度的排毒,而致病力较强毒株的感染组,排毒的比例更高,排毒时间也更长.这些数据表明,H9N2病毒在进化过程中,致病力发生了一定的变化,新近出现了一些对鸡致病力增强的毒株,这提示我们必须重视对H9N2病毒进化和变异的监测,加强对H9N2病毒的防控.     

H9N2亚型禽流感病毒复制特性的基因分析

利用反向遗传技术,通过基因重排方法,以A/chicken/shanghai/F/98（H9N2）禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的6个内部基因为骨架,与A/Chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）AIV的HA和NA基因组合,产生3株H9N2亚型重排AIVs。动物试验发现A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2）和A/Chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）AIV主要在呼吸系统复制,A/chicken/shanghai/F/98（H9N2）株在气管和肺组织的复制能力明显强于A/Chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）AIV株。3株H9N2亚型重排AIVs的动物试验发现HA和NA基因对H9N2亚型AIV在呼吸道的复制特性起主要作用。内部基因对H9N2亚型AIV在呼吸道的复制也有一定的作用。结果表明1994年中国首次分离到的H9N2亚型AIV经过4年的宿主适应和基因进化,加强了其在呼吸系统的复制能力,奠定了气溶胶传播的基础。     

Hemagglutinin glycosylation modulates the pathogenicity and antigenicity of the H5N1 avian influenza virus

The location and number of glycosylation in HA proteins exhibit large variations among H5 subtype avian influenza viruses (AIVs). To investigate the effect of glycosylation in the globular head of HA on the pathogenicity and antigenicity of H5N1 AIVs, seven rescued AIVs differing in their glycosylation patterns (144N, 158N and 169N) within the HA globular head of A/Mallard/Huadong/S/2005 were generated using site directed mutagenesis. Results showed that loss of glycosylation 158N was the prerequisite for H5 AIV binding to the α2,6-linked receptor. Only in conjunction with the removal of the 158N glycosylation, the H5 AIVs harboring both 144N and 169N glycosylations obtained an optimal binding preference to the α2,6-linked receptor. Compared with the wild-type virus, growth of viruses lacking glycosylation at either 158N or 169N was significantly reduced both in MDCK and A549 cells, while replication of viruses with additional glycosylation 144N was significantly promoted. Mutant viruses with loss of 158N or 169N glycosylation sites showed increased pathogenicity, systemic spread and pulmonary inflammation in mice compared to the wild-type H5N1 virus. In addition, chicken studies demonstrated that inactivated de-glycosylation 169N mutant induced cross-reaction HI and neutralization antibody against various clades of H5N1 AIVs. Moreover, this type of glycan pattern vaccine virus provided better cross-protection in chickens compared to wild-type vaccine virus. Thus, the glycosylation alteration of HA should be considered in the global surveillance and vaccine design of H5 subtype AIVs.     

3株H3N2亚型禽流感病毒的基因组特征与演化分析

旨在了解浙江地区家禽H3N2亚型禽流感病毒（AIV）的流行变异情况,采用RT-PCR技术对2021年浙江923份样品进行检测,对AIV分离株进行分子特征及遗传演化分析。结果表明,AIV样品阳性率为7.69%（71/923）;共分离到2株鸡源和1株鸭源H3N2亚型AIVs,其HA和NA基因相似性分别为93.4%～100%和94.0%～99.9%,分离株内部基因片段来源复杂,与H1N2、H1N4、H10N7等亚型亲缘关系密切;遗传进化分析显示,H3N2亚型AIV主要流行于华东地区,鸭是其主要宿主,3株H3N2亚型分离株 HA和NA基因均属于禽源进化分支;分离株HA蛋白裂解位点均为PEKQTR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒特征,HA蛋白与受体结合相关位点为226Q和228G,PB2蛋白与哺乳动物适应性相关的氨基酸位点为627E,均不同于人流感病毒对应蛋白的相关位点（226L、228S和627K）,推测其跨种传播至人的潜力较低;分离株PB1蛋白的66位氨基酸突变为S,提示其对哺乳动物的致病性可能增强。综上所述,本研究分离的H3N2亚型AIV符合低致病性禽流感病毒特征,基因片段来源复杂,跨种传播至人的潜力较低,但是否影响对宿主的致病性仍需进一步探究。     

一株绿鹭源H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

为了解野生水禽绿鹭(Butorides striata)中分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(A/striated heron/Yunnan/2018)的生物学特性;对其进行全基因组序列扩增、测序、进化分析;序列分析显示:该分离株HA、NA基因位于Y280-like分支、PB2、M基因位于G1-like分支、PA、PB1、NP、NS基因位于F98-like分支,分别与H9、H7、H10等多种亚型的AIV同源性较高,该分离株不同基因片段来源较复杂。HA裂解位点氨基酸序列为333PSRSSR↓GL340,符合低致病性禽流感病毒(LPAIV)氨基酸序列特征;S145N突变增加了一个糖基化位点,提示该位点出现可能会使毒株致病性提高,免疫原性发生改变;HA受体结合位点发生Q234L突变,表现出人流感病毒受体结合特性;NA基因出现第63—65位氨基酸缺失,M1发生N30D,T215A突变,M2发生S31N的突变,PB2、PB1、NS、NP、PA关键位点未发生变化,分析结果提示当前分离株已出现耐药性、致病性增强的变化。本研究表明该分离株呈现遗传演化的多样性及基因重组的复杂性,因此加强对野生水禽类禽流感病毒的监测和研究具有重要的公共卫生意义。     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

H9亚型禽流感病毒HF株的分离鉴定和免疫原性评价

2015年,从安徽合肥某养鸡场分离出一株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）,命名为HF株。该毒株鸡胚半数感染量（EID₅₀）为10^9.17/0.1 mL,最小致死量的平均死亡时间（MDT）为87 h。对其HA基因分析发现,其氨基酸裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV特征;HA基因的遗传进化分析结果表明,该分离株属于h9.4.2.5谱系,符合当前毒株流行趋势。将HF株与2006-2018年分离自全国各地的10株H9N2亚型AIV分离株同时制备灭活疫苗,免疫SPF鸡,制备阳性血清,通过交叉血凝抑制试验分析病毒抗原性,结果显示HF株与2014年之前毒株抗原相关性介于0.50~0.56之间,与2014年及之后毒株抗原相关性介于0.89~1.00之间,表明该分离株与2014年之后的流行毒株具有良好的抗原相关性。用0.2%甲醛灭活HF株病毒液,其HA效价在灭活前后未发生变化;用灭活抗原制备油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21 d HI抗体效价几何平均值达到9.0log2以上,可使免疫鸡完全抵抗H9亚型AIV的感染,提供100%的攻毒保护。研究结果表明,HF株具有良好的免疫原性,可作为疫苗候选株用于H9N2亚型禽流感疫苗的研制。     

Isolation,Identification and Immunogenicity Evaluation of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus HF Strain

In 2015,an H9N2 subtype avian influenza virus (AIV) strain was isolated from a chicken farm in Hefei,Anhui,and named HF strain.The results of the chicken embryo proliferation characteristics study showed that the half infection rate of chicken embryo (EID₅₀) was 10^9.17/0.1 mL,and the mean time to death for minimum lethal dose(MDT) was 87 h.The analysis result of HA gene showed that its amino acid cleavage site was located in RSSR↓GLF,which accorded with the characteristics of low pathogenic avian influenza.The genetic evolution analysis of HA gene revealed that the isolate belonged to the h9.4.2.5 lineage,which accorded with the current virus strain epidemic characteristics.The HF strain was prepared with 10 H9N2 subtype AIV isolates which isolated from all over the country from 2006 to 2018 to prepare inactivated vaccines,immunize SPF chickens,prepare positive sera,and analyze the virus antigenicity by cross hemagglutination inhibition test.The results showed that the correlation between the HF strain and the virus antigens before 2014 and was between 0.50-0.56,and the virus antigen correlation after 2014 was 0.89-1.00.This showed that the isolate had good antigenic correlation with epidemic strains in recent years.Inactivate HF strain virus solution with 0.2% formaldehydel,and its HA titer did not change before and after inactivation.After the inactivated virus solution was prepared into an oil emulsion inactivated vaccine to immunize SPF chickens,21 days after immunization,the average value of the HI antibody titer reached 9.0log2.It could make immune chicken completely resistant to H9 subtype AIV infection and provide 100% protection from challenge.The above research results showed that the HF strain had good immunogenicity and could be used as a vaccine candidate strain for the prevention of H9N2 subtype AIV.     

中国H9N2亚型禽流感病毒的流行现状

H9N2亚型禽流感病毒（AIVs）持续暴发和流行，不但给养禽业造成了重大损失，而且给公共卫生安全带来了潜在威胁。为了解中国H9N2 AIVs的流行现状，作者对H9N2亚型AIVs的抗原性、受体结合特性、致病性进行了总结，并且对2016—2020年的流行毒株进行了分析。结果显示，H9N2 AIVs在20多个省市地区流行，其中江西、广东、贵州、江苏等地区暴发次数较多。H9N2 AIVs主要感染鸡，少数感染水禽和小家禽，零星感染人。H9N2 AIVs主要位于h9.4.2.5分支，极少数毒株隶属h9.4.2.1分支。当前H9N2 AIVs受体的结合特性呈现双嗜性或优先结合α-2，6 SA受体。抗原相关位点处的氨基酸呈现出多态性，抗原性正在发生着改变。PB2、PA和HA蛋白获得了一些适应性突变，增强了其在哺乳动物细胞上的复制能力以及对小鼠的致病性，增加了其跨宿主传播感染哺乳动物甚者人的风险。综上所述，人们要加强对H9N2 AIVs流行情况的监测，密切关注其抗原特性及致病性的变化。     

H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作平台的建立

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在自然界中广泛存在和传播,给养禽业造成了巨大损失。为了进一步揭示该病毒的致病机制,本研究采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/1/2006(简称SH1)的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 8个基因片段,并分别克隆至PLLB双向表达载体上。采用8质粒系统共转染293T细胞,转染48 h后加入TPCK胰酶作用2 h,将上清液和细胞一同接种9~11日龄SPF鸡胚,并检测其血凝效价。经序列比对,拯救获得的病毒rSH1的8个基因片段序列均与亲本病毒SH1的序列相同。实验结果表明,本研究成功建立了H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统,为该病毒的致病机理和传播机制研究等奠定了技术平台。