悬浮培养MDCK细胞制备的H9亚型禽流感灭活疫苗免疫剂量试验

为研究由悬浮培养的MDCK细胞制备的H9亚型AIV抗原所制备的灭活疫苗的免疫剂量,在生物反应器中悬浮培养MDCK细胞,接种H9亚型禽流感病毒WD98和HN04种毒,收获抗原液,以2种抗原液分别制备2个毒株的单价油佐剂灭活疫苗。每种疫苗均按照0.3、0.2、0.1、0.05mL/只(107.5 EID50/只~105.52 EID50/只)的剂量接种21日龄SPF鸡,免疫接种后3周采血测定AIV的HI抗体,采血后分别用与制苗株同源的H9亚型AIV种毒静脉注射攻毒,测定疫苗保护率。2种疫苗不同剂量免疫接种后21d的AIV HI抗体水平达到3.8log2~5.6log2,对照组鸡AIV HI抗体均为0log2。攻毒试验证实,以105.52 EID50/只~107.5 EID50/只剂量进行免疫接种,免疫鸡只获得了80%以上的保护。按照兽药典H9亚型禽流感疫苗攻毒保护率90%为合格的标准,悬浮培养MDCK细胞制备的H9亚型禽流感疫苗的最小免疫接种剂量为106.82 EID50/只。     

H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建

为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。     

G1-like型禽H9N2亚型重组流感病毒的拯救及免疫原性评价

为拯救具有高复制特性的G1-like型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)疫苗候选株，利用反向遗传操作技术，将高复制特性H9N2亚型CZ株(Y280-Like)的6个内部基因(PB2、PB1、PA、M、NP、NS)与H9N2亚型40926株(G1-like)的HA和NA基因进行重配，构建G1-like型重组病毒。通过HA、HI试验及基因测序对拯救病毒进行鉴定，并对病毒在鸡胚上的复制能力、遗传稳定性及免疫原性进行评价。结果表明，利用6+2质粒系统成功拯救出G1-Like型H9N2亚型重组流感病毒，并具有良好的复制特性和遗传稳定性；将拯救的重组病毒株灭活后免疫SPF鸡，能刺激产生较高的HI抗体，为防控G1-like型AIV流行提供了技术和疫苗候选株储备。     

悬浮MDCK细胞源与鸡胚源H9亚型禽流感疫苗免疫效力比较研究

为探讨MDCK纯悬浮细胞制备的H9亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果,使用10日龄SPF鸡胚和MDCK纯悬浮细胞分别接种H9亚型禽流感 BX13株病毒,收获抗原液,制备2种单价油佐剂灭活疫苗,按照不同免疫剂量对21日龄SPF鸡进行免疫接种,测定免疫后不同时间的血清HI抗体,免疫后21 d翅静脉攻毒,测定疫苗的保护率。结果表明：2种疫苗分别以0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡后,7 d HI抗体均为0log2,免后14 d、21 d时2种疫苗相同免疫剂量组间HI抗体无明显规律性差异。免疫后21 d,2种疫苗0.1mL/只～0.3mL/只的免疫剂量,各组间HI抗体水平无明显差异,可以达到1∶128以上。攻毒试验表明,鸡胚源疫苗0.1 mL/只、MDCK细胞源疫苗0.2mL/只的免疫剂量可以达到10/10保护。本研究为使用MDCK纯悬浮细胞制备的H9亚型禽流感疫苗的深化研究和应用奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

采用反向遗传学技术构建clade7..2 H5N2亚型禽流感病毒高产疫苗株

为构建H5N2亚型禽流感病毒(AIV)高产疫苗株,研究采用反向遗传操作技术删除Clade 7.2 H5N2亚型AIV A/chicken/Shanxi/Q6/2013(wt-Q6株)血凝素(HA)基因多碱性氨基酸序列,以wt-Q6株HA和神经氨酸酶基因为供体,结合A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV的6个内部片段骨架,构建针对此种变异的H5亚型AIV疫苗株,成功拯救出一株重组病毒r Q6/PR8。该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖滴度,对SPF鸡胚和鸡无致病性,具有低毒高产的特性,符合疫苗候选株的标准。     

鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗的安全性和免疫效力试验

将鸡新城疫、禽流感(H9亚型,SY株)二联灭活疫苗分别以肌肉注射和皮下注射的方式单剂量、单剂量重复、超剂量分别接种28日龄SPF鸡和6月龄产蛋鸡进行安全性试验.同时,将不同剂量疫苗分别接种30日龄SPF鸡,接种后定期采血,分离血清测定HI抗体水平,并于免疫后1、2周从每组试验鸡中抽取10只攻击AIV SY株病毒.结果显示,疫苗以不同剂量接种试验鸡后未见任何不良反应,对产蛋鸡的生产性能基本无影响;试验鸡在免疫后2周即可产生较高水平的HI抗体,其中ND HI抗体几何平均值不低于1∶128,AI HI抗体几何平均值不低于1∶74,攻击AIV SY株病毒后病毒分离率为0,在免疫后20周其HI抗体仍在保护水平以上.表明鸡新城疫、禽流感(H9亚型,SY株)二联灭活疫苗安全性良好,免疫效果确实.     

禽H9N2亚型重组流感病毒疫苗候选株的构建及其免疫效果评价

以G57基因型分离株A/Chicken/Jilin/DH104/2012(H9N2)为HA和NA基因的供体,以A/Swan/Jilin/SN8/2009(H11N6)的6个内部基因作为疫苗候选株的骨架,利用反向遗传技术拯救了1株重组H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rDH104。将该重组病毒灭活后免疫7日龄SPF鸡,28日龄加强免疫1次,血清HI抗体保护水平至少可以维持58d,表明该重组病毒具有良好的免疫原性。本试验为研制与当前H9N2亚型禽流感病毒流行株抗原性相匹配的候选疫苗株提供了依据。     

Re-8株H5亚型禽流感灭活疫苗对野鸟源H5N8流感病毒的免疫保护性研究

为评估当前应用的Re-8株种毒相关禽流感灭活疫苗对野鸟源H5N8流感病毒的免疫预防效果,本研究将重组禽流感病毒(AIV)H5亚型Re-8株灭活疫苗(H5N1亚型,Re-8株)和重组AIV(H5+H7)灭活疫苗(H5N1Re-8株+H7N9 H7 Re-1株)分别以0.3 m L/只的剂量接种3周龄SPF鸡,免疫3周时进行HI抗体检测和攻毒试验。结果显示,上述2种疫苗免疫的SPF鸡血清中针对H5亚型Re-8株抗原的HI抗体均在8 log2以上,以105EID50的剂量、鼻腔感染途径攻击野鸟源H5N8病毒BHG/QH/2/16和BHG/Tibet/3/16后,所有免疫组鸡在14 d观察期内均全部健活,不排毒,而对照组鸡在攻毒后4 d内全部发病、死亡、排毒。现地免疫重组AIV H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)的商品蛋鸡直接进行HI抗体检测和攻毒试验,结果显示,免疫蛋鸡血清中针对Re-8株抗原的HI抗体平均滴度为8.3 log2,以相同攻毒方式和剂量分别攻击2株H5N8病毒后,免疫鸡也获得完全免疫保护,不发病、不死亡、不排毒。本研究结果表明,含有重组AIV H5 Re-8株抗原的灭活疫苗可有效防控野鸟源H5N8流感病毒,为我国及其他国家H5N8亚型禽流感免疫防控提供了科学依据。     

2株H7N9亚型重组禽流感病毒的生物学特性和免疫原性研究

为评估经反向遗传构建的H7N9亚型重组禽流感病毒(AIV)H7-Re1株和H7-Re2株的生物学特性及免疫原性,本研究将这2株病毒分别以104倍稀释接种10日龄SPF鸡胚后,36℃培养,观察鸡胚存活情况并检测病毒HA效价,结果显示96 h时,2株病毒接种的鸡胚全部存活,培养至72 h时其HA效价均为9 log2,均显著高于亲本分离株。测定2株病毒的静脉内接种致病指数(IVPI),结果显示均为0。将2株病毒分别以10~6EID_(50)剂量鼻腔内接种5周龄SPF鸡,进行致病性试验,结果显示,接种后14 d内,2株病毒接种鸡均无临床症状,也不排毒。以2株病毒为种毒分别制备油乳剂灭活疫苗,以0.3 mL/只接种3周龄SPF鸡后3周时检测免疫鸡血清中HI抗体,结果显示,两种疫苗免疫鸡平均HI效价均可达到8.0 log2。于免疫后21 d,H7-Re1株免疫组鸡分别攻击10~6EID_(50)的H7N9亚型低致病力AIV(PG/SHH/S1069/13株)和10~5EID_(50)的高致病力AIV(CK/GX/SD098/17株),进行攻毒试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均全部存活,且无发病和排毒出现。H7-Re2株免疫组鸡于免疫后21 d分别以10~5EID_(50)的剂量进行高致病力H7N9亚型AIV(CK/GX/SD098/17株)和H7N2亚型AIV(DK/FJ/SE0195/18株)的攻毒保护试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒。以上结果表明,以H1N1亚型A/Puerto Rico/8/34株病毒为内部基因供体、经反向遗传学方法构建的H7-Re1株和H7-Re2株均具有生长滴度高、生物安全性高和免疫原性好的特点。本研究为H7N9亚型禽流感疫苗的研制和应用奠定了基础。