H5N1亚型禽流感病毒低剂量感染小鼠发病模型的建立

为模拟哺乳动物感染H5亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)的发病进程,本研究采用对哺乳动物高度致病的H5N1亚型HPAIV株A/bar-headed goose/Qinghai/3/05 (BHG/3/05),以低剂量鼻腔接种小鼠,观察发病、存活、病毒复制及组织病理损伤情况.结果显示,100.4 EID50即能够100％感染小鼠,但发病表现缓慢,死亡延迟至8d以后,存活达60％;体内病毒复制可持续10 d以上,感染后前3d病毒的增殖限于呼吸道,随后扩散至脑、脾、肾等其他器官;组织病理学观察肺脏早期表现出渗出性炎症,第10d发展为典型的间质性肺炎.本研究结果为探讨人禽流感的病理发生机制提供了具有价值的模型.     

H6亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

为快速检测临床样品中的H6亚型禽流感病毒(AIV),本研究通过分析流感数据库中H6亚型的HA基因,在HA保守区设计一对引物,建立一种用于扩增H6亚型禽流感病毒HA基因的一步法RT-PCR检测方法,扩增片段为327bp.采用该方法对H6亚型AIV的尿囊液10倍倍比稀释样品进行检测,结果显示最低检出量为102.5 EID50/mL.用该方法检测其他亚型AIV和鸡新城疫病毒等病原均为阴性,具有良好的特异性.对H6AIV人工感染鸡的咽喉、泄殖腔棉拭子样品进行一步法RT-PCR检测,并与病毒分离进行比较,显示该方法对棉拭子的检测极限可达102.5 EID50/mL,同时利用该方法及病毒分离对临床样品进行检测,两者检测结果一致.实验结果表明该RT-PCR方法具有较好的特异性、敏感性,可以应用于临床样品的实验室检测.     

CHD9:一个新的与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主因子

PA蛋白是禽流感病毒(AⅣ)聚合酶的组成部分,对AIV的复制具有重要作用.为鉴定家鸭体内与AIV PA蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究利用酵母双杂交系统,以表达A/goose/Hubei/65/05(H5N1)AIV PA蛋白的重组质粒为诱饵,筛选家鸭脑组织cDNA文库,鉴定得到一个cDNA片段,经测序分析表明,该cDNA片段编码蛋白为色素域解旋酶DNA结合蛋白9(CHD9).将重组诱饵质粒pDEST32-PA与捕获的鸭cDNA重组质粒共转化MaV203受体菌,进行X-gal显色反应检测,分析结果显示,菌落可以迅速变蓝,并且菌落在SC-Leu-TrpHis+3AT 3种营养缺陷培养基平板上生长良好.证明CHD9与PA蛋白在酵母双杂交系统中具有较强的相互作用.CHD9的初步鉴定为研究AIV在机体中的复制过程奠定了基础.     

杭州湾滩涂粗养塘养殖南美白对虾技术

为研究滩涂粗养环境下养殖南美白对虾的效果。采用传统及新兴的养殖技术方法,对杭州湾滩涂地区粗养殖塘养殖的水质、底质等进行合理的控制;对投饵进行定性、定量的试验研究,以期为寻找合适的滩涂粗养的养殖方式及对南美白对虾补偿生长进行分析验证。根据4个月1茬的养殖试验可知,本养殖模式能有效控制水体氨氮、溶解氧、pH等水质指标,同时,也证明了补偿生长的正确性。本研究将为滩涂环境下的水产养殖,特别是南美白对虾的养殖提供参考和借鉴。     

一株鸡源H6N1亚型禽流感病毒全基因的分子特征

2008年国家禽流感参考实验室在我国禽流感流行病学调查期间分离到1株鸡源H6N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/ZheJiang/80/2008(H6N1)(简称为CK/ZJ/80/08),为了弄清该病毒的分子特征,我们对其8个基因片段分别进行扩增和序列测定,对每个基因进行BLAST分析,找出同源性最高的毒株。利用DNAStar中的Megalign功能进行进化分析。结果表明CK/ZJ/80/08的HA裂解位点附近的氨基酸序列为QIETR↓GLF,推测可能为一株低致病力AIV。其HA基因与日本北海道的A/duck/Hokkaido/228/2003(H6N8)和黑龙江的A/mallard/Heilongjiang/131/2006(H6N2)以及香港早期分离株A/chicken/HongKong/17/77(H6N1)等处于同一分支;NA基因在颈部没有缺失,与A/duck/Tsukuba/718/2005(H1N1)、A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)等处于同一分支;M基因与A/duck/Hokkaido/W90/2007(H10N7)高度同源(同源性为99%);NS基因与A/duck/Denmark/65047/04(H5N2)和A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)处于同一分支。NP、PA、PB1、PB2分别与贵州和江西分离的H5N2亚型AIV的相应基因关系密切,同源性分别为98%、97%、97%、97%。由此推测CK/ZJ/80/08可能是由H6N2、H1N1、H10N7、H5N2等多个亚型病毒重组而成。     

山西亚群H5N1亚型HPAIV对鸭及鸭胚的继代感染研究

2006年从山西省分离获得的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)曾引起免疫鸡群的大量死亡,与我国之前分离的病毒抗原差异性较大,称为"山西鸡型"抗原变异株。本研究应用该亚群代表毒株CK/SX/2/06(H5N1),研究该病毒对SPF鸭和鸭胚的致病性,并通过病毒在鸭和鸭胚内的连续传代,探讨该亚群病毒在鸭和鸭胚中的进化规律。结果表明,病毒对3周龄鸭呈低致病性,在各脏器中的复制能力较弱;鸭感染病毒后无明显临床症状,排毒水平较低并且不能感染同居鸭。病毒在3周龄鸭和10日龄鸭胚中分别继代感染3代和5代后,对3周龄鸭仍呈低致病性且HA基因未发生氨基酸位点变化。病毒不能致死3周龄鸭和1日龄雏鸭,但能致死10日龄～23日龄鸭胚,而且对鸭胚的致病性随着鸭胚日龄的增长逐渐减弱,致死鸭胚时间从对10日龄鸭胚24h致死到对23日龄鸭胚72h致死直至对25日龄鸭胚只感染但不致死。病毒对鸭呈低致病性且在鸭群传播中保持着基因水平和致病性上的相对稳定,对不同日龄鸭胚、1日龄和3周龄鸭致病性的不同表现,与目前存在于我国的其他亚群H5N1HPAIV对鸭致病性和进化特点上呈现出明显的差异,并对家禽养殖业存在威胁。     

一株H4亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传演化分析

2008年对我国南方活禽市场进行流行病学监测时从鸭体内分离鉴定一株H4亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/duck/Guangxi/912/2008(H4N2)(缩写为DK/GX/912/08)。为了解该株H4亚型AIV的来源、特征及其分子演化规律,本研究对其全基因序列进行测定,并与GenBank登录的相关病毒进行遗传演化分析。结果表明:DK/GX/912/08HA基因切割位点附近的氨基酸序列(PEKASR↓GLF)符合低致病力AIV的特征,其分子遗传演化关系属于东半球谱系的欧亚分支;NA基因与A/duck/Jiangxi/1286/2005(H5N2)在同一分支内,核苷酸同源性为98.1%;PB2基因与A/duck/Nanchang/4-165/2000(H4N6)处于同一分支;而NS基因与A/duck/Jiangxi/1786/03(H7N7)同源性最高。因此,推测DK/GX/912/08可能是不同来源的基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。     

H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠肺组织蛋白质组分析

为鉴定禽流感病毒(AIV)感染状态下的差异表达蛋白,本研究将H5N1亚型AIV感染组与对照组小鼠肺组织蛋白样品分别进行双向电泳分离,并采用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件进行分析.在AIV感染72 h后,共有9个表达差异显著的蛋白点(ratio＞2,p＜0.05),而且该蛋白在感染组均呈上调表达.将差异蛋白进行串联质谱分析,并对其中7个蛋白进行鉴定,包括:interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3(IFIT-3)、ATP依赖的干扰素反应蛋白1(ADIR1)、γ干扰素诱导的p47鸟苷三磷酸酶(IRG)、T细胞受体a TA27、气味受体S86、胞苷单磷酸激酶2(Cmpk2)和肌球蛋白.将前3个蛋白基因采用荧光定量PCR方法进行mRNA水平的验证,所获得的结果与双向电泳结果一致.本研究为在蛋白质组水平进一步分析H5N1亚型AIV与宿主相互作用奠定了基础.     

两株鸭源H6N2亚型禽流感病毒的序列分析及对鸡的致病性研究

为了解鸭源H6N2亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对两株鸭源H6N2亚型AIV [A/duck/Hube/Sd061/2008(HB/061/08)和A/duck/Fujian/S2080/2009(FJ/080/09)]进行序列分析和致病性试验.序列分析显示:两株病毒的HA和NA基因均来源于我国近年流行的H6亚型病毒株,但是HB/061/08株的内部基因可能来源于H9、H5等其他亚型.与病毒株HB/061/08 NP、PA、PB2基因的核苷酸同源性最高的病毒株为A/environment/Hunan/2-84/2007(H9N2);与M、PB1和NS基因的核苷酸同源性最高的病毒株分别为A/duck/Zhejiang/11/2000(H5N1)、A/chicken/Hebei/7/2008(H9N2)和A/chicken/Henan/L1/2008(H9N2).两株病毒的抗原差异性较显著,相关系数为0.49;用106 EID50病毒剂量感染4周龄SPF鸡,结果显示FJ/080/09株不能感染鸡,而HB/061/08株在鸡体内能够高效复制,并通过咽喉和泄殖腔持续排毒.鸡群感染后第3d采取脏器样品,在气管和肺部能够检测到病毒存在,部分脏器和器官的组织学观察显示存在一定程度的病理变化.以上数据表明,H6亚型AIV在跨越不同宿主感染的传播过程中,对新宿主适应能力的差异导致对其致病性的差异.