H9N2亚型禽流感病毒纯化及病毒HA蛋白定量方法研究

为实现H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗上下游过程的控制,本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯度离心分别进行澄清、浓缩和分离纯化;其次,采用改装过的高效液相色谱仪系统(HPLC)准确定位和收集病毒离心区带,并对该区带进行SDS-PAGE和Western blotting分析,同时考察该收集方式的线性和重复性;然后,在此基础上优化病毒液的澄清工艺以提高病毒回收率;最后,观察还原SDS-PAGE分离的H9N2亚型AIV蛋白条带的共迁移情况并确定糖苷酶PNGase F脱糖基处理的最佳条件,采用Image J软件分析SDS-PAGE图谱中4个主要病毒蛋白条带(NP、HA1、M1和HA2)的灰度以确定流感病毒血凝素的含量。结果表明,HPLC收集的病毒离心区带的蛋白浓度与PEG6000浓缩的上清体积在8～32 mL范围内具有良好的线性关系(R~2=0.994),且该收集方式重复性好,批内和批间变异系数分别为1.29%和4.11%。病毒液经过澄清、浓缩和分离纯化后,最终的病毒回收率为79.55%。纯化的H9N2亚型AIV的蛋白浓度为1 000μg/mL时,经糖苷酶PNGase F脱糖基处理后便能得到条带清晰平整且分离良好的SDS-PAGE图谱。经灰度分析,HA含量占总病毒蛋白含量的46.18%。本研究初步建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法,为H9N2亚型AIV全病毒灭活疫苗的研发和生产提供了简单、准确的检测手段。     

禽流感病毒 H9和 N2基因双重 RT-PCR 方法的建立

为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒（AIV ）的方法,根据AIV H9和N2基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了 H9亚型和N2亚型AIV双重RT‐PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT‐PCR扩增,可得到545 bp H9基因条带和341 bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341 bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性;结果表明该双重RT‐PCR最低能检出100 fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。     

禽流感病毒H9和N2亚型双重RT-PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,根据AIV H9亚型和N2亚型基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了H9亚型和N2亚型AIV双重RT-PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT-PCR扩增,可得到545bp H9基因特异性条带和341bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。结果表明该双重RT-PCR最低能检出100fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。     

H7N9亚型禽流感病毒HA基因mRNA的构建

H7N9亚型禽流感病毒(AIV)持续给家禽及人类健康造成威胁。为构建H7N9亚型AIV (简称H7N9AIV) mRNA疫苗，本研究以AIV分离株A/chicken/Yunnan/SD024/2021 (H7N9)(简称CK/YN/SD024/2021)的HA基因为目的基因、选择来自人β-球蛋白和非洲爪蟾β-球蛋白的不同编码基因序列作为HA基因的非翻译区(UTR)，构建了中间转录质粒p GEM-YN和p XT7-YN，以2个质粒为模板通过体外转录制备了mRNA m H7-YN-p GEM和m H7-YN-p XT7；将2种mRNA转染HEK293T细胞，western blot鉴定结果显示2种mRNA转染的细胞均可检测到约为70 ku的HA蛋白条带和50 ku的HA1蛋白条带；通过间接免疫荧光试验(IFA)确定最适转染剂量和HEK293T细胞中HA蛋白的动态表达，结果显示，3μg mRNA转染106个细胞并于转染24 h后荧光信号强度均最强；将2种mRNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，均可通过IFA检测到HA蛋白的表达。以上结果表明，本研究正确构建了2种含H7N9 AIV HA基因的m...     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV) HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定.结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长.单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞.研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现.S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用.这提示该病的防控面临着新的挑战.     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

H3N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒(AIV)且同时区分H3N2亚型AIV的方法,本研究根据H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT-PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518bp为AIV M基因、418bp为N2亚型AIV NA基因、271bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518bp、271bp和518bp、418bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对H3N2亚型AIV的检测下限为100pg,96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。     

禽流感病毒 H3N2亚型三重 RT-PCR 检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒（AIV ）且同时区分 H3N2亚型AIV 的方法,本研究根据 H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M 基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT‐PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518 bp为AIV M 基因、418 bp为N2亚型AIV NA基因、271 bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518 bp、271 bp和518 bp、418 bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518 bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对 H3N2亚型AIV的检测下限为100 pg ;96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。     

广州市活禽市场7株H9N2亚型禽流感病毒全基因进化分析

为了解广州市活禽交易市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异特点和流行情况,本研究对2015年5月~2016年6月分离的7株H9N2亚型AIV进行全基因组的遗传进化分析。结果显示,7株H9N2亚型AIV均属于G57基因型,其中有4株分离株的部分内部基因与人源H7N9亚型病毒株基因的核苷酸同源性在99%以上。HA裂解位点未发现碱性氨基酸的替换,HA潜在糖基化位点存在添加或缺失现象,HA蛋白aa155位和aa226位分别为苏氨酸(T)和亮氨酸(L),具有结合人流感病毒受体能力。NA蛋白颈部存在氨基酸缺失,M1蛋白N~(30)D、T~(139)A、T~(215)A,NS1蛋白P~(42)S等突变可能会增加病毒的致病性。结果表明广州市活禽交易市场H9N2亚型AIV的基因型趋于稳定,但其糖基化位点和受体结合位点等呈现多样化,并且H9N2亚型AIV的内部基因能够为其它亚型AIV提供内部片段,其对养殖行业及人类健康产生潜在威胁,仍需对其进行持续的监测。     

H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

In order to develop a rapid and simultaneous assay for H7N9 subtype avian influenza virus （AIV）, three pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the hemagglutinin (HA) gene of H7 subtype AIV, the neuramidinase (NA) gene of N9 subtype AIV, and the matix (M) gene of all subtypes AIV. The reaction conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of this method were evaluated to develop a triplex PCR assay. It was shown that H7N9 subtype AIV could be amplified into three specific bands by this triplex PCR, the lengths of these bands were 330 (H7 AIV), 207 (N9 AIV) and 632 bp (all AIV), respectively. Samples containing H7 or N9 subtype AIV could be amplified into two specific bands, which were 330 and 632, 207 and 632 bp, respectively. Samples containing other subtypes AIV could be amplified into a 632 bp specific band. No specific band was amplified from other avian pathogenic virus. Sensitivity test results showed that as low as 10³ copies/μL H7N9 subtype AIV could be detected. This triplex PCR could simultaneously diagnose H7N9 subtype AIV, single H7 subtype AIV, single N9 subtype AIV and other subtype AIV in one tube. This assay was a rapid, specific and sensitive method for the detection of H7N9 subtype AIV. It could be applied in rapid diagnosis for clinical samples, and also provided a technical support to prevent and control H7N9 subtype AIV.     

应用多重引物RT-PCR快速诊断禽流感亚型

将本实验室分离保存、已经过PCR扩增、核酸测序鉴定的三种不同亚型禽流感病毒(AIVH5N1、H6N2、H9N2)分别接种鸡胚,收集尿囊液,分离提取AIV总RNA。参考H1￣H15亚型禽流感病毒的核蛋白(NP)基因序列以及H5、H6、H9亚型AIV血凝素(HA)基因序列,设计四对引物:NP1,NP2;H5P1,H5P2;H6P1,H6P2;H9P1,H9P2,混合为PCR扩增多重引物MP1,下游引物NP2、H5P2、H6P2,、H9P2混合为逆转录反应多重引物MP2。AIV总RNA在相同反应条件下经MP2逆转录,用MP1进行PCR扩增,AIVH5亚型材料得到205bp,563bp两条扩增带,AIVH6亚型材料得到205bp,233bp两条扩增带,AIVH9亚型材料得到205bp,690bp两条扩增带,都与实验设计相符合,阴性材料没有扩增带。该方法成功实现四对引物进行RT-PCR反应同时检测出AIV,准确诊断H5、H6、H9三种禽流感亚型,检测时间短,特异性强,能及时检测出AIV亚型。     

Expression of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus HA Gene and Preparation of its Mono-specific Serum

To prepare the mono-specific serum to diagnose H9N2 avian influenza virus (AIV),this test extracted H9N2 subtype AIV RNA and then amplified the upper HA1 gene,the middle HA2 gene and the lower HA3 gene by RT-PCR,respectively.Then they were inserted into expression vector pET-32a(+) and transformed into BL21(Rosetta) expression strain.The expressed proteins were used to immune Kunming White mice to prepare antiserum.Recombinant fusion proteins of HA1 HA2 and HA3 were obtained successfully and they showed good immunogenicity.Indirect immunofluorescence assay (IFA) showed that the two serums obtained by the upper HA1 and the middle HA2 could react with the H9N2 subtype AIV,while that of the lower HA3 could not.Recombinant Marek's disease virus (MDV) MZC12 HA/NA also proved that the serums prepared by HA1 and HA2 could recognize the expression of HA gene.The mono-specific serum of H9N2 subtype AIV was prepared successfully,which could lay the foundation for the diagnosis and research of H9N2 subtype AIV.     

H9N2亚型禽流感病毒HA基因的表达及其单因子血清的制备

为了制备特异性识别H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的单因子血清,本试验提取H9N2亚型AIV RNA,RT-PCR后,分别扩增上段HA1、中段HA2和下段HA33段基因。将他们插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(Rosetta)菌株中表达。将表达的蛋白常规免疫昆明白小鼠,以制备抗血清。结果显示,成功获得3段重组融合蛋白,且均具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,上段HA1、中段HA2制备的单因子血清均可与H9N2亚型AIV反应,而下段HA3则不能。重组马立克氏病病毒(MDV)MZC12 HA/NA同样证明HA1、HA2两段制备的单因子血清能识别HA基因的表达。本试验成功制备了识别H9N2亚型AIV HA的单因子血清,为H9N2亚型AIV的鉴别诊断及研究奠定了基础。     

H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种能同时快速检测H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中H9亚型 AIV的HA基因和DTMUV的NS2基因序列,分别设计了1对针对H9亚型AIV和DTMUV保守基因序列的引物。利用这2对引物对混有H9亚型AIV和DTMUV的cDNA模板进行二重PCR扩增,得到了2个大小与试验设计相符的特异性扩增条带。利用本试验建立的二重PCR对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。利用这2对引物对H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为6.3和 6.6 pg。对临床235份样品检测的结果表明该二重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。     

H9亚型禽流感病毒HA1基因的克隆表达及其生物学活性的初步分析

根据GenBank已发表序列设计引物，通过RT-PCR成功获得了H9亚型禽流感病毒北京分离株A／Chicken／Beijing／1／96（H9N2）的HA1片段，经序列分析HA1片段与其他已发表序列同源性为95％～98％。将HA1片段克隆入pET．28a的多克隆位点构建重组质粒pET28-H9HA1并转化宿主菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实，H9HA1片段得到表达，并且表达的蛋白带分为42Ku和23Ku两条。血凝实验和血凝抑制实验表明原核表达的HA1蛋白不具备血凝活性，其阳性血清不能引起血凝抑制。交叉反应实验证实原核表达的重组蛋白能与禽流感病毒H9亚型单特异性血清反应，而与禽流感病毒H5、H7亚型以及其他禽传染病病原微生物单特异性血清无交叉反应。说明表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性，有开发成为H9亚型禽流感检测试剂的可能。     

我国H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白145和153位抗原位点变异分析

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)易发生抗原漂移,但识别我国H9N2亚型AIV流行株抗原差异性的关键抗原位点还不清楚.选取两株血凝抑制(HI)效价高的H9N2亚型AIV单克隆抗体2E4与2D6对A/Chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)毒株施加抗体压力制备单抗逃逸突变株,鉴定抗原位点...