禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对H5N6亚型AIV特异性扩增出418bp和251bp目的片段,对H5Ny(y≠6)亚型AIV扩增出418bp目的片段,对HxN6(x≠5)亚型AIV扩增出251bp目的片段,对其他亚型和常见的禽病病原体均未扩增出目的片段;敏感性结果显示,该方法对H5亚型和N6亚型最低检测限为1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亚型和N6亚型AIV检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,为H5亚型和N6亚型AIV临床检测以及防控提供了有效方法。     

应用多重引物RT-PCR快速诊断禽流感亚型

将本实验室分离保存、已经过PCR扩增、核酸测序鉴定的三种不同亚型禽流感病毒(AIVH5N1、H6N2、H9N2)分别接种鸡胚,收集尿囊液,分离提取AIV总RNA。参考H1￣H15亚型禽流感病毒的核蛋白(NP)基因序列以及H5、H6、H9亚型AIV血凝素(HA)基因序列,设计四对引物:NP1,NP2;H5P1,H5P2;H6P1,H6P2;H9P1,H9P2,混合为PCR扩增多重引物MP1,下游引物NP2、H5P2、H6P2,、H9P2混合为逆转录反应多重引物MP2。AIV总RNA在相同反应条件下经MP2逆转录,用MP1进行PCR扩增,AIVH5亚型材料得到205bp,563bp两条扩增带,AIVH6亚型材料得到205bp,233bp两条扩增带,AIVH9亚型材料得到205bp,690bp两条扩增带,都与实验设计相符合,阴性材料没有扩增带。该方法成功实现四对引物进行RT-PCR反应同时检测出AIV,准确诊断H5、H6、H9三种禽流感亚型,检测时间短,特异性强,能及时检测出AIV亚型。     

H4、N2和所有亚型禽流感三重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测H4、N2和所有亚型禽流感的方法,分别针对H4亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N2亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因保守序列,设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,对三重反应体系进行特异性和敏感性验证,建立了H4、N2和所有亚型AIV三重RT-PCR检测方法,并用该法对临床样品进行检测。建立的方法能特异性扩增H4、N2和所有亚型AIV,与其他禽病病原体不发生交叉反应;对H4、N2和所有亚型AIV至少能检测到6 pg/μL。在185份临床样品的检测中,检出4份H4、10份N2和19份AIV阳性。所建立的三重RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,为快速检测H4、N2和所有亚型AIV提供了有效的方法。     

H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

试验旨在建立可同时鉴别检测H9和H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的二重RT-PCR方法。根据GenBank中H9和H6亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。用该法对H9和H6亚型AIV混合感染样品、H9亚型AIV单一感染样品和H6亚型AIV单一感染样品进行扩增,结果均得到对应的目的条带,而对其余亚型AIV及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。该法对H9和H6亚型AIV的检测下限均为5×10⁴拷贝/μL。本研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、稳定性和重复性良好,可同时鉴别检测H9与H6两种亚型AIV,为H9与H6亚型AIV的监测提供技术支撑。     

Development of a Duplex RT-PCR Assay for Detection of H9 and H6 Subtype AIV

This experiment was aimed to develop a method for simultaneous detection of H9 and H6 subtype avian influenza virus (AIV).Two pairs of specific primers were designed according to the conserved regions sequences of H6 and H9 AIV HA gene,a duplex RT-PCR simultaneous detection of H9 and H6 subtype AIV was developed by optimizing the PCR system such as the concentration of different primers and annealing temperature.It showed that all samples could be amplified specific bands from H9 subtype AIV single infection samples or H6 subtype AIV single infection samples,and the samples mix infection these two subtypes AIV.No specific bands of the same sizes were amplified from genomic materials of other avian pathogens.The detection limit of the duplex RT-PCR was 5×10⁴ copies/μL. It suggested that this duplex RT-PCR assay was a specific,sensitive,stable and repeatable method for detection of H9 and H6 subtype of AIV,and could provide technical support for the monitoring of H9 and H6 subtype AIV.     

禽流感病毒H5和H9亚型多重RT-PCR快速检测方法的建立

根据禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）和血凝素（HA）基因序列，设计1对用来鉴定A型AIV特异性引物（NP—F,NP—R）和2对用来鉴定AIV H5和H9不同亚型特异性引物（H5-F，H5-R；H9-F，H9-R），建立了多重RT—PCR快速检测方法。该方法能同时从一种病毒扩增出2条核酸带。分别为型（NP：330bp）和亚型（H5A：550bp，或H9A：490bp）。通过对105份样品进行检测。并与病毒分离及琼脂扩散（AGP）血清学方法作平行对比，两者之间符合率达100％；试验灵敏度为10^2ELD50。结果表明，建立的多重RT—PCR为检测H5、H9亚型AIV提供了一种快速、经济、易行的技术。     

H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种能同时快速检测H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中H9亚型 AIV的HA基因和DTMUV的NS2基因序列,分别设计了1对针对H9亚型AIV和DTMUV保守基因序列的引物。利用这2对引物对混有H9亚型AIV和DTMUV的cDNA模板进行二重PCR扩增,得到了2个大小与试验设计相符的特异性扩增条带。利用本试验建立的二重PCR对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。利用这2对引物对H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为6.3和 6.6 pg。对临床235份样品检测的结果表明该二重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。     

Establishment of a Duplex Real-time RT-PCR for Detection of H6N1 Subtype Avian Influenza Virus

According to the sequences of HA and NA genes of H6 and N1 subtype avian influenza virus (AIV),two pairs of specific primers and two TaqMan probes with different fluorescence were designed.The duplex Real-time RT-PCR assay was developed and optimized to simultaneously detect H6 and N1 subtypes AIV in one reaction.The result showed that the specificity of this assay was high and only amplified H6 and N1 subtypes AIV,and was not cross-reactive with other H and N subtypes AIV,newcastle disease virus and infectious bronchitis virus.The detection limit of this assay was 100 copies/μL of H6N1 subtype AIV.This newly developed duplex Real-time RT-PCR assay was a rapid,specific and sensitive method for the detection of H6N1 subtype AIV,and it could provid a technical support to prevent and control H6N1 subtype AIV.     

H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针.经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法.该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL.本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑.