新时期细胞工程教学改革与实践

根据细胞工程教学的实际情况,从教学内容、手段、方法等方面提出了提高教学质量的建议,为细胞工程教学改革提供新思路。     

酪蛋白和巨细胞病毒复合启动子激活人乳铁蛋白cDNA基因在转基因小鼠乳腺中的表达

为了提高转基因动物乳腺特异性表达水平,构建了两种不同启动子的乳腺特异性表达载体,以比较其乳腺特异性表达效果.应用山羊β-酪蛋白或牛αs1-酪蛋白调控序列、鸡β-球蛋白隔离元件、巨细胞病毒(CMV) 基因表达涮控元件构建了,乳腺特异性表达复合启动/增强子(Pcmv) ,以单一的酪蛋白启动子作为对照,与人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体,并制备了转基因小鼠.经ELISA检测,复合启动/增强子构件指导人乳铁蛋白cDNA在原代转基因小鼠乳腺中重组人乳铁蛋白(rhLF) 表达水平(2.0～8.1 g·L-1) 明显高于单一酪蛋白启动子构件(0～12 mg·L-1) ,而在所有转基因小鼠的血清和唾液中未检测到rhLF.结果提示:酪蛋白-Pemv复合启动/增强子不仅可提高转基因小鼠乳腺特异性表达水平,而且具有良好的乳腺表达特异性.     

克隆羊的STR-PCR亲权鉴定

建立了利用STR-PCR技术检测克隆羊的DNA多态性的方法,即利用带有荧光标记的特异性引物,扩增产物带有荧光,在allelic ladder的指示下计算出扩增产物大小,即等位基因的大小。用该方法对克隆羊的8个DNA位点进行了遗传多态性分析,成功地对各位点进行基因型分离检测,结果表明克隆羊的基因组DNA和供核羊的基因组DNA是一致的。此方法和其他方法检测的结果完全一致。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同，设计和合成了等位基因特异性PCR引物，建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法，并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示，该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌，检测灵敏度达100PgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定，鉴定出33株鸡白痢沙门菌，符合率为94．3％。表明，建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

麻鸭白细胞介素17的原核表达及鉴定

为表达麻鸭白介素17(duIL-17),本研究提取ConA刺激的麻鸭脾脏淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增duIL-17基因片段,将该片段插入克隆载体pCR2.1中构建重组质粒pCR2.1-duIL17.将duIL-17基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-duIL17,将其转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达.测序结果显示,duIL-17与参考序列(EU366165.1)相比较第174位碱基由C突变为T,并且为沉默突变.SDS-PAGE和western blot分析显示,诱导表达的重组蛋白GST-duIL17主要以包涵体形式存在,分子量大小约为45 ku,duIL-17与抗鸡IL-17抗体具有良好反应性.本研究为制备duIL-17单克隆抗体提供了实验依据.     

禽源大肠埃希菌质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的检测

从我国部分地区病、死家禽中分离到大肠埃希菌403株。按照CLSI(clinical and laboratory standards institute)推荐的K-B药敏纸片法对其中的344株分离株进行药敏纸片试验;根据GenBank上发表的序列,设计并合成了五对引物,对所有分离细菌进行质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的扩增:qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-ib-cr和qepA。1993年-1996年禽源大肠埃希菌分离株仅对萘啶酸的耐药率超过60%;2001年-2008年禽源大肠埃希菌分离株对1-3代7种喹诺酮类药物的耐药率均超过58%。在403株禽源大肠埃希菌中共检出3(0.7%)株qnrB阳性菌株,2(0.5%)株qnrS阳性菌株,5(1.2%)株aac(6′)-ib-cr阳性菌株以及5(1.2%)株qepA阳性菌株,未检测到qnrA阳性菌株。结果显示,近20年来,我国禽源大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药性不断上升,同时,质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因在禽源大肠埃希菌中呈不断上升的流行趋势。     

蛋鸡传染性喉气管炎流行特点与防制

一流行特点1基本流行情况本病及病原于1925年在美国洛岛由May和Tittste最早发现,以后发生于美国、欧洲等养鸡发达地区,上世纪50年代至60年代在我国报道,90年代在徐州周边地区呈地方性流行,目前本地区仍呈地方性流行,但疫点和流行范围在逐渐增加和扩大。     

鸡白痢沙门氏菌Mini-Tn5转座子插入突变

将氯霉素（Cm）抗性基因克隆到pUTmini-Tn5Km2载体中,利用含卡那霉素（Km）和氯霉素（Cm）抗性基因的pUTmini-Tn5Km2（Cm）转座载体将Km和Cm抗性基因随机插入鸡白痢沙门氏菌基因组中,以相应的抗生素进行筛选,获得大量在不同位点插入突变的突变体,从中筛选鸡白痢沙门氏菌某功能缺陷型突变株。通过对突变株的基本特征以及PCR鉴定后,再进行插入基因定位。结果表明,Km和Cm抗性基因已成功转座至鸡白痢沙门氏菌基因组上;基因定位显示突变株均有且只有1个插入位点,插入位点的位置不尽相同。这为研究鸡白痢沙门氏菌功能基因和筛选特定突变株提供了必要的基础。     

禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因的克隆及序列分析

根据GenBank公开发表的H9N2型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计1对引物,用RT-PCR方法成功扩增出H9N2型禽流感病毒分离株A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因,凝胶电泳结果显示,扩增产物为1.7 kb的单一条带,与预期结果相符.将PCR扩增片段连接到pCR2.1-T载体上,重组质粒酶切鉴定正确.序列测定分析结果显示,所获序列与GenBank中收录的H9N2亚型分离株核苷酸同源性最高达99%,与原型毒株A/Furkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)氨基酸同源性为89%.对HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明,此毒株为低致病力毒株.     

鸡传染性支气管炎病毒分离株核衣壳基因克隆、序列分析和真核表达

根据GenBank公开序列自行设计一对引物，采用RT—PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）W和C9001分离株完整的核衣壳（N）基因，并将其克隆至pMD18-T载体进行核苷酸序列测定和分析。结果表明，扩增的2个IBV分离株核衣壳基因片段长度均为1230bp，编码409个氨基酸，彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为88．0％和89．5％，与GenBank中有代表性的参考毒株相应基因核苷酸和氨基酸序列比较显示，w株核苷酸序列与GenBank中的广东分离株（AY646283）同源性最高，为94．1％，氨基酸序列同源性为94．6％；与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．1％～88．0％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～90．7％之间；C9001株与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．4％～99．8％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～99．8％之间。从核衣壳基因编码的氨基酸序列的系统进化树可见，W株与C9001株处于不同的进化分枝，亲缘关系较远。同时将核衣壳基因构建于真核表达质粒pVAX1中，用脂质体法将重组质粒转染入COS-7细胞中，间接免疫荧光检测出核衣壳蛋白的体外表达。研究结果为进一步研究IBV核衣壳蛋白的结构与功能以及基因工程疫苗的研制奠定了基础。