猪乙脑病毒河南分离株CSF.ZMD-3的分离鉴定及分子进化分析

采集河南省规模化猪场流产母猪死胎脑脊液作为样本,通过细胞盲传培养分离乙型脑炎病毒流行毒株,对新分离的病毒进行分子生物学鉴定,获得1株分离株并命名为CSF.ZMD-3。DNA序列测定及比对分析该分离株与已报道毒株基因的序列同源性,确定该分离毒株为乙脑病毒。使用MEGA3.1软件对CSF.ZMD-3毒株主要结构蛋白E蛋白的基因序列进行分子进化分析,确定CSF.ZMD-3为基因Ⅲ型乙脑病毒。     

猪乙脑病毒BHK-21细胞传代株BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60的全基因组序列分析

为研究猪源乙脑病毒分离株基因遗传稳定性,对猪源乙脑病毒分离株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21细胞上连续传代60次后的病毒全基因组进行序列测定及分析。结果表明,BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60基因组全长均与各自的亲本毒株BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3一致,均为10 977 nt,在2个病毒基因组的10 701 nt位点处均插入1个碱基G。与亲本毒株相比,2个细胞传代毒株的病毒基因组经连续传代后趋于稳定,均有10个位点发生氨基酸突变,这些突变主要集中在E蛋白区域。核苷酸序列同源性比对分析发现,与其他JEV参考毒株相比,BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60与弱毒疫苗株SA14-14-2的核苷酸序列同源性较高,分别为99.6%和95.9%,其氨基酸序列与猪源野毒分离株SH0601和HW的氨基酸序列同源性较高,分别为98.2%、86.4%和98.3%、86.5%。     

猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析

利用RT-PCR技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析,从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒(JEV)M基因和E基因具有高度同源性的预期产物.在3日龄乳鼠脑内接种种猪精液上清,10 d左右即出现典型神经症状,并且病死鼠脑组织RT-PCR结果均为阳性.用病死鼠脑组织研磨上清接种BHK-21细胞,感染60...     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

乙型脑炎病毒感染小鼠原代神经元细胞的miRNA表达谱差异分析

研究乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染后小鼠原代神经元细胞miRNA的表达谱差异，初步探讨JEV与宿主在miRNA水平的相互作用。分别提取JEV感染48 h后的小鼠原代神经元细胞和未染毒组细胞，高通量测序分析miRNA的表达谱并进行差异分析，选取显著差异表达的miRNA进行实时定量PCR验证。结果筛选出26个差异表达显著的miRNA，其中，18个表达上调，8个表达下调。小鼠原代脑神经元细胞中mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-223-5p、mmu-miR-147-3p、mmu-miR-155-5p和mmu-miR-146a-5p的表达促进JEV-E基因在神经元细胞中表达，而mmu-miR-301a的表达抑制JEV-E基因的表达。神经元细胞中miRNA的表达影响JEV的复制，为进一步研究JEV致神经功能异常机制提供研究方向和理论支持。     

DT40细胞slgMλ轻链基因的克隆鉴定及原核表达

本研究利用RT-PCR技术，从鸡法氏囊淋巴瘤细胞系DT40中扩增slgMλ轻链基因并在E．coli中进行了表达。序列分析结果表明，sIgMλ轻链基因全长852nt，含有一个长度为657nt的ORF及长度为195nt的3′-UTR，该基因与鸡Igλ基因的序列同源性为95％，差异位点主要存在于λ轻链的可变区。氨基酸序列预测结果表明，DT40sIgMλ蛋白与鸡Igλ蛋白的序列同源性为92．6％。构建的原核表达载体pET-λ在E．coli BL21（DE3）中成功的获得大量表达。本实验为进一步研究sIgM在IBDV感染法氏囊B淋巴细胞中的作用奠定了基础。     

镰刀菌诱导后苦瓜幼叶cDNA文库的构建和鉴定

以白粉病菌侵染的苦瓜幼叶为材料,以λTrip IEx 2为载体,利用SMART技术构建了1个由镰刀菌病原诱导后的苦瓜幼叶cDNA文库.结果显示,初始文库的滴度为4.0×106pfu.mL-1,扩增后滴度为8.1×109pfu.mL-1,插入片段大小分布在500~3 000 bp,平均值大于1 000 bp,重组效率为98%.     

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建与转化

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出大约1．5kb的片段．PCR产物经回收后，与Pc^CAMBIA1303连接并转化大肠杆菌DH5α，阳性重组子经PCR鉴定，表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体．用基因抢转化小麦幼胚，经组织培养得到了含有海藻糖合成酶基因的小麦植株．     

以合成肽为抗原检测O型口蹄疫病毒抗体 ELISA方法的建立和评价

作者以固相法合成特异性FMDV主要保护性抗原VP1上的表位肽,将其与载体蛋白BSA偶联,作为包被抗原,制备检测抗O型口蹄疫病毒(FMDV)抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核.结果表明该方法的敏感性为95.12%,特异性为100%.检测199份血清标本,与UBI FMD VP1试剂盒的符合率达到98.49%,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达到96.98%.该多肽ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控口蹄疫抗体水平.     

猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的效价测定及保存稳定性研究

为评估市售商品化猪乙型脑炎(JE)弱毒活疫苗的质量以及实验室条件下疫苗的保存稳定性,采用TCID50效价测定和RT-PCR检测病毒的保守基因(E基因和C/pr M基因)2种方法对2012年市场销售的主要国产疫苗产品进行了质量评估,同时将供试疫苗产品置-30℃保存3、6、9、12个月后分别取样测定乙脑病毒(JEV)TCID50效价。结果表明,市售的猪乙脑同类疫苗中不同品牌产品之间活病毒含量差异较大,最高可达104.33TCID50/头份,但部分产品含量极低,甚至难以检测到活病毒;E基因和C/pr M基因的RT-PCR扩增产物丰度的差异与TCID50测定结果基本一致。多数疫苗产品在有效期内病毒效价基本稳定,同一厂家生产的疫苗保存期越短,其中相对活病毒越多,效价越高。