鸡TIGAR基因真核表达质粒的构建及其抗凋亡功能评价

【背景】 TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】 构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank（登录号：XM_417232.6）中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体（Flag-CMV14）后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase（PARP）裂解情况。此外还将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒（Flag-TIGAR）经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒（Flag-TIGAR）的实验组与未转染质粒（MOCK）组或转染空载体（Flag-CMV14）组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著（P<0.01）。流式结果显示：24 h 检测转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为11%（早期凋亡7.8%,晚期凋亡3.2%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率仅为4%（早期凋亡3.7%,晚期凋亡0.3%）,转染Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR组,且差异显著（P<0.05）。48 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为20.3%（早期凋亡14.3%,晚期凋亡6.0%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为6.4%（早期凋亡4.8%,晚期凋亡1.6%）,转染Flag-CMV14组的细胞早期凋亡和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR的组,且差异极显著（P<0.01）。【结论】成功扩增出鸡TIGAR基因,并构建了其真核表达质粒,通过Western Blot和流式实验均证实过表达TIGAR后可降低细胞的凋亡程度并有利于细胞存活。     

试论美语和英语的差异及其由来与发展

简明而又系统地论述美国英语同英国英语在读音、拼写、用词和语法方面的差异,并从社会和时代发展的观点及美国历史变迁和经济发展的视角,分析了产生这些差异的主要原因,展望了两种英语相互弥补、融为一体、形成一种标准英语的乐观前景.     

H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/LY1/2017株反向遗传操作系统的建立

为了构建H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/LY1/2017的反向遗传操作平台,通过RT-PCR技术分别扩增该毒株的8个基因片段,并分别克隆至双向转录表达载体PHW2000中.8个质粒共转染293T/MDCK混合细胞,96 h后将细胞板反复冻融3次收获细胞悬液,将其接种10日龄SPF鸡胚,96 h后收集尿囊液并将拯救毒株命名为rH9N2,测定其HA效价为1:256.rH9N2在HA、MDT、EID50、TCID50以及病毒生长曲线、空斑等方面保持了与亲本毒株一致的生物学特性.本研究成功构建了A/Chicken/Shandong/LY1/2017的感染性克隆,为今后通过基因替换、定点突变技术研究H9N2亚型禽流感病毒致病性的分子机制奠定了基础.     

基于含水率的固化污泥基质体中固化反应的分析

[目的]了解固化污泥基质体中固化反应程度。[方法]采用新型固化剂固化污泥,通过含水率的变化,研究不同水泥掺量比、石粉掺量比对不同龄期的固化污泥基质体固化反应程度的影响。[结果]固化污泥基质体中的含水率随时间延长而降低,固化剂的掺入量越大,含水率越低;固化反应主要发生在前7 d;固化后污泥基质体的相对含水率随时间而变大;固化剂掺入量的增加对固化反应有推动作用,但也与固化剂的类型有关。[结论]可以用含水率的变化来反映和了解固化反应进行程度,基于相对含水率估算固化反应程度的预测公式适用于固化污泥等固化污染土。     

应用G3BP1稳转细胞系监测应激状态下的应激颗粒形成

哺乳动物细胞受到应激刺激后，会在细胞中形成致密的颗粒状结构，该结构被称为应激颗粒（stress granules，SG），其中G3BP1是应激颗粒重要的组成成分和标志蛋白。为了动态监测SG的形成情况，构建稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系。首先，扩增G3BP1基因，并将其克隆到慢病毒载体中，从而获得重组质粒Lenti-GFP-G3BP1，利用三质粒慢病毒包装系统包装为表达GFP-G3BP1蛋白的慢病毒颗粒，并感染HeLa细胞，通过嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，随后，采用有限稀释法筛选出稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa单克隆细胞系，并采用Western blot和直接免疫荧光方法检测细胞系中GFP-G3BP1蛋白的表达及功能。结果发现，在荧光显微镜下可以观察到明显的G3BP1细胞质特异性荧光，Western blot结果显示GFP-G3BP1特异性条带，说明稳定表达GFP-G3BP1的HeLa细胞系构建成功。最后，作者利用亚砷酸钠/热休克/新城疫病毒处理细胞系后对GFP-G3BP1表达形态进行动态监测，证实了细胞受到刺激后，SG逐渐积累的过程。该细胞和相关动态监测方法为后续SG和新城疫病毒的相关研究奠定了基础。     

应用CRISPR/Cas9敲除HeLa细胞DDX21基因对新城疫病毒复制的影响

解旋酶家族是一类对所有生物都至关重要的酶,主要功能是基因解旋,DEAD/H-box家族RNA解旋酶是一类重要的解旋酶。DEAD-box RNA解旋酶DDX21被证实可能调控宿主细胞先天性免疫。新城疫病毒(NDV)是一种对养禽业危害严重的病原,NDV能够通过多种手段调控宿主先天性免疫,为了探讨DDX21如何调控NDV复制,本研究应用CRISPR/Cas9系统建立DDX21基因敲除的HeLa细胞系,并验证其对NDV复制的影响。针对DDX21基因共设计6条sgRNA,构建敲除载体并电转染细胞,通过药物筛选、亚克隆筛选后,以PCR和Western blot进行敲除效率的双重鉴定,并比较野生型和DDX21敲除细胞中NDV的复制效率。结果显示,由于DDX21对细胞生长至关重要,因此仅获得一株DDX21杂合子敲除细胞,Western blot结果显示DDX21表达量被显著抑制,NDV对在敲除细胞上的复制滴度明显低于野生型细胞,说明DDX21发挥正调控NDV复制的作用,本试验为DDX21调控抗病毒先天性免疫研究奠定了基础。     

DUSP6通过负向调控ERK1/2通路抑制IBV的增值

为了阐明ERK(extracellular signal-regulated protein kinases)1/2通路在传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)复制过程中的作用以及双特异性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6,DUSP6)对ERK的反馈性负向调控在IBV复制过程中的作用。本研究通过Western blot、Northern blot检测发现:IBV感染Vero和H1299细胞可导致ERK1/2的磷酸化水平和DUSP6表达均上调;利用MEK1/2特异性抑制剂U0126处理病毒感染的细胞后,可明显下调ERK1/2的磷酸化,同时抑制病毒的增殖;利用DUSP6的特异性抑制剂BCI抑制DUSP6的活性或者用siRNA阻断DUSP6的表达后,再感染IBV,发现ERK1/2的磷酸化水平增高,病毒蛋白的表达上调。综上,推测IBV感染细胞激活ERK1/2信号通路,有助于病毒的复制,同时,细胞通过诱导表达DUSP6,负向调控ERK1/2的磷酸化水平,抑制病毒增殖。     

商务英语缩略语的起源、结构和语法功能分析

如普通的词语一样,结构特殊的商务英语缩略语具有一般的语法功能。本文试图就商务缩略语的起源、结构和语法功能做出探讨,以帮助商务工作者提高他们翻译商务文件与信函的能力。     

稳定表达TIGAR基因的BHK-21细胞系的构建及其对新城疫病毒增殖效果的评价

TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和抗细胞凋亡功能。由于新城疫病毒（NDV）引起细胞死亡是通过诱导凋亡产生,所以提高宿主细胞的抗凋亡水平,有助于延长细胞存活时间进而提高子代病毒的滴度。本研究根据GenBank中预测仓鼠TIGAR基因和鸡TIGAR基因设计引物,分别扩增仓鼠和鸡的TIGAR基因,并构建各自的慢病毒包装质粒,以适合NDV增殖的BHK-21细胞为基础构建稳定过表达TIGAR细胞系（BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR）。使用Western blot、DNA测序和qPCR对TIGAR基因表达水平进行鉴定,Western blot和流式仪检测细胞的自然凋亡率。选取新城疫病毒强中弱3种毒株分别感染构建的细胞系,测定病毒滴度。结果显示：重组细胞系BHK-21-chTIGAR细胞和BHK-21-hamTIGAR细胞经过Western blot和DNA测序等检测表明构建成功,TIGAR基因表达量高且无野生型BHK-21细胞污染。qPCR检测细胞系的稳定性结果显示,TIGAR基因在BHK-21细胞中经过30次传代均可稳定表达。Western blot和流式细胞检测结果显示：BHK-21-hamTIGAR细胞的凋亡率低于野生型BHK-21细胞和BHK-21-chTIGAR细胞;病毒生长曲线结果显示：强毒株ZJ1病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID₅₀（5.67,72 h）高于BHK-21-chTIGAR细胞（5.53,72 h）和野生型BHK-21细胞（5.27,72 h）;中强毒株SH15病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID₅₀（4.90,96 h）要高于BHK-21-chTIGAR细胞（4.57,96 h）和野生型BHK-21细胞（4.67,96 h）;弱毒株LaSota病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID₅₀（4.07,96 h）要高于BHK-21-chTIGAR细胞（3.90,96 h）和野生型BHK-21细胞（3.77,96 h）。综上所述,所构建的BHK-21-hamTIGAR细胞系具有明显的抗凋亡功能,且有利于新城疫病毒的高水平复制,有望进一步开发完善成为新城疫病毒疫苗生产所用的细胞株。