蓝舌病病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及初步应用

<正>蓝舌病最早于1905年发现于南非,主要存在于南纬40°至北纬53°之间的地区,包括美洲、非洲、澳洲以及亚洲。我国自1979年在云南分离到蓝舌病病毒以来,湖北(1983)、安徽(1985)、四川(1988)、山西(1993)、广西(1985)等省份分别报道发现了蓝舌病,此后蓝舌病普查中有29个省(市、地区)发现该病〔1〕。2006~2008年蓝舌病相继出现在荷兰、卢森堡、丹麦、瑞士、捷克以及英国,同年受到感染的     

广西Tanay病毒粒子形态观察

为了研究广西分离Tanay病毒粒子的形态特征,用2013年从广西马山县采集致倦库蚊标本分离的1株Tanay病毒(GX13M50)接种C6/36细胞进行复壮及培养、固定,采用超薄切片透射电镜对GX13M50病毒粒子进行形态学观察。结果表明:该分离株能够引起C6/36细胞产生明显病变,在接种96 h后,被感染的细胞聚集、折光性变强、脱落;感染细胞的超薄切片电镜观察结果表明,病毒粒子为椭圆形,直径大约50 nm,具有一个短的突起。本研究对Tanay病毒粒子的形态进行了研究,为该病毒的形态学诊断及防控提供依据。     

阿卡斑病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立和比较试验

为建立阿卡斑病毒抗体检测方法,本研究以纯化的阿卡斑病毒作为包被抗原,以制备的抗阿卡斑病毒的多克隆抗体与待检血清竞争结合抗原,采用方阵滴定法优化反应条件,建立了阿卡斑病毒竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。通过对60份牛、羊阿卡斑病毒抗体阳性血清和40份阴性血清样品的检测,确定阴阳性样品抑制率(PI)临界值为60%;特异性试验结果显示,该方法对BTV-1、BTV-4、BTV-9、BTV-16、小反刍兽疫、中山病病毒、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、羊痘和O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,标准阳性血清1颐128倍稀释时,检测结果仍为阳性,SNT最低检出为,敏感性高于微量血清中和试验(SNT)检测结果(1颐64);批内和批间变异系数(CV)在0.54%~5.27%和0.3%~9.3%之间,具有较好的可重复性;用该方法与法国IDVET公司的同类试剂盒对85份牛、羊血清样品同时检测,结果显示二者符合率为91.76%,可以替代进口同类产品。本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于阿卡斑病毒抗体检测和流行病学调查。     

蓝舌病病毒16型毒株在不同细胞中的增殖特性研究

为研究蓝舌病病毒16型毒株在不同细胞中的增殖特性,本实验将BTV-16型毒株接种在BHK-21、Vero、C6/36传代细胞系及山羊肾原代细胞,通过细胞敏感性试验、病毒感染生长曲线以及qRT-PCR方法检测BTV-16型毒株在上述不同细胞中的复制效率和增殖情况。试验结果表明,BTV-16型毒株在BHK-21、Vero、C6/36及山羊肾原代细胞中均能增殖,但产生CPE的时间及病毒滴度有所差异。病毒在BHK-21、Vero细胞上病变较快,山羊肾原代细胞次之,C6/36细胞病变不明显。从病毒滴度和核酸检测结果来看,病毒在BHK-21细胞中的增殖效率与Vero细胞基本一致,并且病毒在这两种细胞中的增殖效率明显高于在山羊肾原代细胞和C6/36细胞。本试验为蓝舌病病毒分离、抗原制备、致病性以及反向遗传学研究提供了细胞学研究基础。     

2013—2016年云南省江城县牛羊蓝舌病血清流行病学调查

为了解近年来云南省江城县蓝舌病病毒（BTV）的感染和流行情况,从2013年5月至2016年4月连续3年在江城县设立监控动物群,每年选择BTV病原及抗体检测阴性牛10头、羊5只作为哨兵动物,用于BTV抗体监测和病毒分离。应用BTV C-ELISA抗体检测试剂盒,对哨兵动物进行血清抗体检测,应用鸡胚、C6/36细胞和BHK-21细胞进行病毒分离。结果显示：连续3年的哨兵动物BTV抗体阳性率分别为40.35%、44.08%、50.65%; 3年内共分离到45株BTV,包括1~5型、15~16型、21型和24型共9种血清型。结果表明,江城县蓝舌病流行有逐年加重趋势,且呈现多种血清型毒株交叉感染状况,亟需加大BTV监测力度,及时发现毒株变化。     

蓝舌病病毒BTV-1型的分离鉴定

<正>蓝舌病(BT)是由蓝舌病病毒(BTV)通过吸血昆虫-库蠓叮咬传播,感染牛羊等反刍动物的一种非接触性传染病,分布于热带、亚热带和温带地区。主要侵害绵羊,其病症是颊黏膜和胃肠道黏膜严重的卡他性炎症,病羊精神沉郁,食欲丧失,常出现血样下痢,常因蹄冠上皮脱落而跛行,被毛断裂,甚至全部脱落。蓝舌病病毒可经胎盘感染胎儿,引起流产、死胎或胎儿先天性异常,山羊和牛隐性感染,症状不明显,目前国际上的一些流行毒株可导致牛发     

云南蓝舌病病毒1型毒株M6基因序列分析

为了解云南蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV) 1型M6基因流行株的遗传变异及其与国内外流行病毒的遗传进化关系,试验从细胞培养物中分别提取4株云南分离株BTV-1 (Y863、SZ120169、6-12和7-12) RNA,用M6基因特异引物进行RT-PCR扩增和测序,采用生物信息学软件对获得的M6基因编码区序列进行核苷酸、氨基酸同源性比对及遗传进化分析.结果表明,分别获得4株云南分离株BTV-1 M6基因1 763 bp序列;4株云南分离株BTV-1核苷酸同源性在95.2%~99.9%之间,氨基酸同源性在97.6%~99.8%之间,1979年师宗分离的Y863病毒毒株与2012年师宗(SZ120169)、2013年江城(6-12、7-12)分离的3株病毒毒株核苷酸同源性分别为95.5%、95.2%和95.2%,氨基酸同源性分别为97.6%、98.4%和98.2%,而近两年(2012、2013)分离病毒核苷酸和氨基酸同源性较高,分别在96.9%~99.9%和99.1%~99.8%之间;遗传进化分析发现,4株云南分离株BTV-1为Eastern基因群病毒,它们之间核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%~99.9%和97.6%~99.8%;进一步分析发现4株云南分离株BTV-1与希腊及澳大利亚 BTV-1型毒株亲缘关系较近,核苷酸和氨基酸同源性分别为90.4%~95.6%和95.1%~99.1%,而与地中海国家(意大利、法国、阿尔及利亚、摩洛哥和突尼斯)和南非毒株关系较远,核苷酸和氨基酸同源性分别在83.8%和95.7%以下.4株云南分离株BTV-1属于Eastern基因群病毒,云南分离株BTV-1 M6基因在自然进化中发生遗传变异缓慢,该基因可以用来进行BTV-1基因群分布及毒株的地理区域来源相关的研究.     

广州市及其周边地区马群中盖塔病毒血清流行病学调查

为初步了解广州市及其周边地区马群中盖塔病毒(Getah virus,GTV)感染情况,对2019年该区域内马场及动物园等场点的马匹进行了血清流行病学回顾调查。采用血清微量中和试验,对17个采样点184份血清样品进行了GTV中和抗体检测,并对结果进行了统计分析。结果显示:184份马血清样品中,GTV中和抗体平均阳性率为26.09%(48/184),中和抗体滴度为1:10～1:640;不同采样点的中和抗体阳性率介于0～43.75%,差异明显(P 0.05),其中动物园和4个马场的中和抗体阳性率均大于30%;从年龄分布看, 15～20岁组别的中和抗体阳性率最高(35.29%),其他依次为0～5岁、 10～15岁和 5～10岁组,中和抗体阳性率分别为33.33%、27.14%和22.36%。结果表明,广州市及其周边地区不同年龄段马匹中广泛存在GTV感染,且部分地区感染较严重。结果提示,该地区已形成GTV循环感染的自然生境,因此有必要加强马匹的GTV监测,并采取虫媒控制等防控措施,以减少GTV流行和可能带来的经济损失。     

流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定

流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与鉴定。将采集于哨兵动物的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;通过血清中和试验与病毒Seg-2、Seg-3 ORF区的序列分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和qRT-PCR方法对EHDV感染动物血液中的抗体水平与病毒核酸进行监测。结果如下:从2013年8月采集自云南师宗县哨兵牛的血样中分离出一株EHDV(毒株号YNSZ/V269/2013),血清中和试验结果表明分离的病毒为血清型7型(EHDV-7);Seg-2、Seg-3序列分析表明分离的病毒属EHDV-7 Eastern型,与日本毒株和澳大利亚EHDV-7型毒株具有最近的亲缘关系。哨兵动物病毒核酸转阳后,血清抗体迅速上升,3周后达最高点并能在该水平持续较长时间,而病毒核酸含量却迅速下降,7周后已经检测不到。本研究首次报道了EHDV-7型毒株在中国的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性。研究结果可为进一步开展中国EHDV-7型病毒的全基因组测序、流行病学调查、诊断方法的建立和致病性等相关研究提供基础。     

内蒙古呼和浩特市摇蚊鉴定与COI基因序列分析

为了解内蒙古呼和浩特市摇蚊的分类鉴定与COI基因序列特征。2016年7月在内蒙古自治区呼和浩特市采集摇蚊标本,在体视显微镜下观察摇蚊形态学特征,同时提取虫体基因组DNA,用COI基因特异引物PCR扩增和序列测定,然后采用生物信息学软件进行核苷酸同源性和遗传进化分析。共采集摇蚊标本41只,其中雌蚊38只(92.68%)、雄蚊3只(7.32%)。9只摇蚊具有与Ch.riparius相似形态学特征,32只摇蚊具有与Ch.muratensis相似的形态学特征。序列分析结果显示3只摇蚊COI基因核苷酸同源性在83.3%～99.8%,其中HS1-1-1、HS1-1-2两只蚊虫与Ch.riparius位于同一进化分枝内,核苷酸同源性均为99.8%;HS1-3-2与Ch.muratensis位于同一进化分枝内,核苷酸同源性为99.6%。