用3′RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3′末端序列

应用 3′RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒 ( FMDV) OH99株基因组 3′端真实序列。测序结果表明 ,所扩增的目的基因片段长 15 0 0 nt,包括 3D基因部分序列、3′端非编码区 ( Non- Coding Region,NCR)和 Poly( A)尾巴 ,其中 3′NCR位于终止密码子 TAA之后 ,长 93nt,Poly( A)尾序列至少含有 5 6个 A。与参考毒株进行序列比较 ,结果显示 ,OH99株与 OTY TW/ 97株的核苷酸同源性较高 ,为 91.4 % ,而与 O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低 ,其同源性分别为 6 8.1%、71.0 %、70 .2 %。 3′NCR的末端存在保守性较高的基序 :CCCTCAGATG,TTTTCCC-CGCTTCCT。本研究为进一步研究 FMDV基因组的功能、构建 OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。     

含74个腺嘌呤poly（A）尾的猪水泡病病毒HK／70株3’非编码区的克隆及其特征分析

应用3’RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒（SVDV）HK／70株基因组3’端的真实序列。测序结果表明，所扩增的目的基因片段长4200nt，包括非结构蛋白编码区（P2和P3）、3’端非编码区和poly（A）尾，其中3’NTR位于终止密码子TAA之后，长99nt，poly（A）至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较，结果显示，HK／70株与J1’73、H／3’76和AUG／22／90株的核苷酸同源性较高，为99．0％（仅第65位碱基不同），而与NET／1／92参考毒株的核苷酸同源性较低，为83．3％，与人柯萨奇病毒B5UK／54株（UK／54-CB5）的同源性为75．7％。同时对3’NTR的二级结构进行分析，并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明，它们具有协同变异性，有共同的祖先，显示出3’NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。     

口蹄疫OX株全基因组cDNA的分子克隆、序列测定及分析

采用RT-PCR法对FMDV OX株基因组全序列进行了分子克隆与测序。结果表明不含poly(C)序列和poly(A)尾巴的OX株基因组全序列长8104nt,开放读码框(ORF)长6969nt、编码2322aa,5’UTR长1040nt,3’UTR长95nt。应用分子生物学软件将OX株与FMDV其它参考毒株进行序列比较,并对其基因特征进行分析。结果显示,OX株与OTwyl／97的核苷酸同源性最高,在基因组功能未知区和3A编码区具有两处明显的缺失现象,其一是在3A编码区有30nt的连续缺失,这与OTwyl／97株相同,其二是在功能未知区域有44nt的缺失,这与OTwyl／97株相同,与OAkesu58相似(43nt缺失)。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究

对猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构基因 (ORF1)和非编码区分别进行了克隆和测序 ,并对其基因特征作了分析。结果表明 ,CH_1a株ORF1全长 11882nt,其中ORF1a长 75 12nt、ORF1b长 4374nt。它们与VR2 332株的核苷酸同源性分别为 89%、92 % ;与LV株的核苷酸同源性分别为 5 4%、6 3.3%。ORF1编码两个聚合蛋白 ,其中ORF1a编码的聚合蛋白经裂解后产生 6个成熟的非结构蛋白 (Nsp1α、Nsp1β、Nsp2_5 ) ,以Nsp2的变异性最为显著 ,它与LV株的氨基酸同源性为 41%。ORF1b编码的聚合蛋白经裂解后 ,产生 4个成熟的非结构蛋白 (RdRpCP2_4) ,其中RdRp为病毒的复制酶 ,CP4表现出较大的变异性 ,与LV株的氨基酸同源性为 48%。在ORF1a_ORF1b的衔接区有保守的庚核苷酸滑动序列和拟节结构 ,它们是核糖体移码翻译所必需的结构。在基因组末端存在非编码区 ,其中 5’NCR长 190nt,比LV株 5’NCR短 31nt,其核苷酸同源性为 6 1%。 3’NCR长 15 1nt,比LV株 3’NCR长 37nt,保守性稍高 ,其与VR2 332株和LV株的核苷酸同源性分别为 95 .4%和 78.2 %。在 3’NCR末端有一个poly(A)尾巴 ,长 2 0nt。在Poly(A)尾上游有保守的八核苷酸序列 ,是复制酶识别并结合的区域。本研究进一步证实CH_1a株在基因型上属于北美洲型     

猪源口蹄疫病毒China99/S株基因组全长cDNA的构建及其感染性鉴定

提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmB Ⅰ/Xma Ⅰ、Xma Ⅰ/BamH Ⅰ、BamH Ⅰ/Not Ⅰ、Hpa Ⅰ/Kpn Ⅰ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带有聚合酶Ⅰ的pPⅠ cDNA3.1(+)转录载体内,最终得到重组质粒pP1-FMDVcDNA3.1(+);然后对该质粒进行序列测定.结果表明,China99/S株基因组全基因组序列长8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR长1 064 nt,蛋白编码区核苷酸序列为6 318 nt,编码1个由2 106个氨基酸组成的聚合蛋白,3′NCR长93 nt,其后是含有38个A碱基的Poly(A)尾.其中5′NCR引入含41个C的Poly(C)片段.将pPⅠ FMDVcDNA3.1(+)用脂质体转染法导入BHK-21细胞,传代培养,可以观察到典型的FMDV致细胞病变效应.利用CPE、电镜、动物试验、RT-PCR和序列测定进行检测,结果表明,从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源FMDV China99/S株重组病毒.     

口蹄疫病毒OT株的全基因组序列测定及比较分析

参考GenBank上已发表的口蹄疫病毒(FMDV)全长基因组序列,设计了覆盖基因组全长的数对引物,通过RT-PCR方法对口蹄疫病毒OT株进行分段克隆及序列测定.结果表明不含poly(C)序列的OT株基因组全序列长8 142 nt,开放读码框(ORF)长6 969 nt、编码2 322 aa,5'UTR长1 004 nt,3'UTR长93 nt,3'UTR之后为23nt的poly(A)尾巴.应用分子生物学软件将OT株与FMDV其它参考毒株进行序列比对,并对其基因特征进行分析.结果显示,OT株的假结节(Pseudoknots)从第415-499位连续缺失85 nt,但是其3A基因却未发生碱基的缺失.其VP1基因的核苷酸同源性与O/Akesu58、OMⅢ两株最高,但OT株在进化时间上要比O/Akesu58、OMIII早很多,其毒株起源和遗传衍化关系还需要进一步的关注.     

猪O型口蹄疫病毒强弱毒株VP1基因的克隆与序列分析

本研究根据口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因的序列，设计并合成了1对用于扩增整个VP1基因的引物（5P、P6）。从细胞培养液或组织中提取总RNA，通过PT－PCR扩增，从F29株O3I3株和T509株中均获得了1条约740bp的DNA电泳带。将PCR产物双酶切后电泳回收，插入到相应双酶切的pUC18质粒中，获得了重质粒。通过PCR鉴定，证明重组质粒pUCVP1/F29,pUCVP1/0313,pUCVP1/T509均插入了VP1基因。对上述3个重线质粒进行测序后分析，F29强毒株与O313、T509弱毒株相比，其核苷酸序列同源性分别为98．75％和99．06％；因F29株核苷酸发生3个碱基缺失与1个碱基替换，故推导的氨基酸序列同源性分别仅为44．13％和41．32％，而T509和O3I3株相比，其核苷酸、氨基酸序列同源性分别为99．37％和95．31％。通过序列分析发现，本研究的3个毒株与国内大多数毒株（包括1997年台湾暴发FMDV所分离的毒株，除O／A／58株外）均属同一基因型，核苷酸序列同源性为85％－94％；而与国外毒株相比，属不同的基因型，核苷酸序列同源性仅为81％－82％，其推本研究的3个毒株与国内分离的大多数毒株的VP1基因的氨基酸序列同源性高达87％－95％，本项研究对猪O型FMDV的强弱毒株VP基历进行克隆与序列分析，将进一步丰富我国FMDV毒株VP1基因资料库，为更加科学地防制FMD提供分子水平依据。     

猪瘟弱毒C81株全基因组测序及分子结构预测

参照已发表的猪瘟病毒弱毒株的序列,设计7对覆盖全长基因纽的引物,通过RT-PCR从感染猪瘟病毒弱毒株的PK-15细胞中扩增得到7个cDNA片段,分别克隆到pMD18-T载体并测序,利用DNASIS软件获得猪瘟病毒C81株全基因组序列（GenBank：AY665656）。C81株基因组全长12310nt,只有一个大的开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白。序列分析表明,c81株开放阅读框与其它各毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性变化较大,分别为84．4％～99．6％和91．6％～99．4％。同时,我们绘制了26株CSFVORF的进化树,比较了CSFV5’非翻译区核苷酸序列并推测其二级结构,发现不同毒株之间存在较大的差异,另外对C81株聚蛋白的功能域和三维结构进行了预测。     

口蹄疫病毒3ABC基因的克隆与测序

参考 Gen Bank中发表的猪源 O型口蹄疫病毒 3 ABC的基因序列 ,设计一对特异引物 ,以猪源 FMDV/ O/ CC株基因组 RNA为模板 ,RT-PCR扩增 3 ABC基因 ,并克隆到 p MD1 8-T载体中。测序结果显示 ,FMDV/ O/ CC株 3 ABC基因 c DNA长 1 2 81 bp,编码为 42 7个氨基酸残基组成的多肽。核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性比较发现 ,FMDV/ O/ CC株和 FMDV/O/ TW/ 99株 3 ABC基因亲缘关系密切。核苷酸同源性为 97% ,推导氨基酸序列同源性为96.3 %。     

我国部分地区鸡贫血病病毒全基因组核苷酸序列的比较与分析

本研究测定了3个鸡贫血病病毒（Chinken anemia virus,CAV）国内分离株及12个直接来源于临床样品的CAV毒株全基因组序列,结果表明15个CAV毒株的全基因组长度和结构与已报道的其它CAV毒株一致,长度均为2298nt,包含有3个重叠的ORFs。与GenBank发表的13个毒株序列进行序列比较发现,所有毒株核苷酸序列的相似性在95．2％～99．5％之间,CAV全基因组序列有2个高度变异区（HVR）,分别位于1033nt～1470nt和1858nt～2193nt。CAVORF3变异度最高,其5’端2／5处和3’端2／5～1／5处为2个高度变异区。ORF2变异度也较高,主要出现在5’端1／4处,ORFI最为保守。以CAV全基因组核苷酸序列和ORF3核苷酸序列为基础分别构建的CAV毒株分子进化树,均可以将全部CAV毒株划分为2个基因群。我国部分地区分离的大多数毒株,属基因Ⅰ群,与德国Cux-1等主要流行毒株有较为相近的亲缘关系;其它CAV国内毒株,属基因Ⅱ群,与日本G6株和TR20株有着更为相近的关系。     

单股正链RNA病毒基因组3＇非编码区功能

单股正链RNA病毒数量众多,对人、动物和植物造成很大的危害。病毒基因组3＇末端都具有一段非编码区,基因组3＇非编码区在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。本文简单介绍了单股正链RNA病毒基因组3＇非编码区结构的预测、测定和功能的研究方法,并重点概括了不同单股正链RNA病毒3＇非编码区一级序列、茎-环结构、假结体、TLS等结构在病毒基因组的复制、转录和翻译中的调控作用以及目前存在的问题。     

"13428"生态高效蛋鸡养殖管理模式

贵州安顺柳江畜禽有限公司是由国家级养殖加工重点龙头企业河南鹤壁柳江集团于2004年在贵州安顺双堡镇山京畜牧场建立的子公司,公司成立五年来,在各级党委、政府和各职能部门的大力支持下,以"小鸡蛋大品牌"和绿色生态高效养殖为战略,在带动农户养殖上摸索出了一套绿色生态高效蛋鸡养殖管理模式.     

Pathologic effects of 2,2',4,4',5,5'-and 2,3',4,4',5,5'-hexabromobiphenyl in white leghorn cockerels

Pathologic effects of 2,2',4,4',5,5'-hexabromobiphenyl (HBB), 2,3',4,4',5,5'-HBB, and a commercial mixture of polybrominated biphenyls (PBB) were compared in White leghorn cockerels. Diets containing 1, 10, or 100 ppm PBB, 4 or 10 ppm 2,3',4'4',5,5'-HBB, or 10 or 62 ppm 2,2',4,4',5,5'-HBB were fed for 28 days. Doses of 10 ppm of each chemical were used to provide a direct comparison of toxicity. Since nearly 4% of PBB consists of 2,3',4,4',5,5'-HBB and approximately 62% consists of 2,2',4,4',5,5'-HBB, effects of doses of 4 and 62 ppm, respectively, were compared with effects of 100 ppm of PBB to determine if either of the congeners were mainly responsible for the pathologic effects caused by the mixture. Liver weights were increased in cockerels fed diets containing 62 ppm of 2,2',4,4',5,5'-HBB or 10 or 100 ppm PBB. Hepatocytes were enlarged and vacuolated and lymphoid cells of the bursa of Fabricius were depleted by 10 ppm 2,3',4,4',5,5'-HBB, ppm 2,2',4,4',5,5'-HBB, and 10 or 100 ppm PBB. These dietary concentrations caused ultrastructural changes in hepatocytes consisting of vacuolation, increased smooth endoplasmic reticulum, swollen mitochondria, and disruption of mitochondrial cristae. When either of the congeners were given in concentrations relative to their concentrations in PBB, they were less toxic than the mixture. When concentrations in diets were equal, PBB caused more severe effects than 2,3',4,4',5,5'-HBB. The least effects were seen with 2,2',4,4',5,5'-HBB. Results indicate that the two congeners chosen for study are not individually as toxic as the parent mixture.     

The Effect of Cyclic Adenosine 3', 5' Monophosphate,Methyl Xanthines and Nicotinic Acid on Plasma Nonesterified Fatty Acids in Sheep

The intravenous injection of 3'', 5'' AMP, 10 mg/kg, caused an immediate rise in blood glucose in normal sheep. In sheep where liver glycogen was depleted by pretreatment with 100 mg/kg of nicotinic acid, the blood glucose response was greatly reduced. The glycogenolytic effect of 3'', 5'' AMP was thus easily demonstrated. The injection of 3'', 5'' AMP was followed by an immediate rise in NEFA, which was most pronounced in the pretreated animals. After the initial increase there was a fall in NEFA in both the normal and the pretreated animals. The role of hyperglycemia for the NEFA response to exogenous 3'', 5'' AMP was discussed. It seemed possible that hyperglycemia may modify the initial increase in NEFA. The later fall in NEFA was discussed as a complex response, which may be the result of the action of several hormones, which may be released by 3'', 5'' AMP injection. Nicotinic acid and pyridyl-3-acetic acid showed a potent antilipolytic activity. Nicotinic acid caused a rebound elevation of NEFA. No rebound was observed after pyridyl-3-acetic acid. Pyridyl-3-acetic acid, however, did not change NEFA when administered orally. Pyridyl-2-acetic acid had no antilipolytic effect. Of the methyl xanthines caffeine and theophylline showed about the same lipolytic activity. Theobromine was quite ineffective.     

Immunohistochemistry for 2',3'-cyclic nucleotide-3'-phosphohydrolase in 63 bovine peripheral nerve sheath tumors

To establish a simple and uniform classification of bovine peripheral nerve sheath tumors (PNSTs), 63 tumors from 44 cattle were examined histologically and immunohistochemically with antibodies against S100 protein and 2',3'-cyclic nucleotide-3'-phosphohydrolase (CNPase). Immunohistochemically, all the tumors were positive for S100 protein, CNPase, or both. Four types of PNST were recognized: 35 schwannomas, 9 neurofibromas, 14 hybrid (neurofibroma-schwannoma) tumors, and 5 malignant PNSTs. Axons were identified by immunohistochemistry for neurofilament in a proportion of tumors of each type of PNST. In conclusion, bovine PNSTs commonly have both schwannomatous and neurofibromatous areas. Moreover, the Schwann cell markers S100 protein and CNPase, in combination with antibodies against neurofilament, are valuable diagnostic tools to classify bovine PNSTs.     

中国荷斯坦奶牛铁蛋白基因3'端克隆及序列分析

本研究旨在克隆和分析中国荷斯坦奶牛的铁蛋白(FTH)基因,为该基因的功能研究和有效利用提供理论依据.运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从公犊肝脏组织中扩增出FTH基因的3'端cDNA序列,并利用生物信息学方法对该基因的氨基酸序列进行分析.结果表明,FTH基因3'端cDNA全长为489 bp,编码81个氨基酸;经生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白无N端信号肽及跨膜区,相对分子质量为9.1253 kD,理论等电点为5.19,脂肪系数为85.56,总亲水性为-0.342,其一级结构中存在4个功能结构域;二级结构元件以α-螺旋和β-旋转为主;同源序列分析表明,中国荷斯坦奶牛与原牛FTH氨基酸的相似性最高(99％);系统进化树显示,在该基因座位上中国荷斯坦奶牛与所测物种的亲缘关系均较远.本研究有助于揭示FTH家族基因的进化历史,为对其进行深入的功能分析和利用研究提供参考.     

‘贵妃’枇杷高产高效栽培技术

‘贵妃’枇杷是福建省农业科学院果树研究所通过实生选育的白肉枇杷新品种,2014年6月30日通过全国热带作物品种审定委员会审定。近年来在福建、四川、重庆、广东等地引种示范,取得了良好效果。为了更好地促进福建枇杷品种结构调整、品质提升和枇杷产业的可持续发展,本文从肥水管理、生草栽培、树体管理、花果管理和病虫害防治等方面介绍了‘贵妃’枇杷高产高效栽培技术。