猪瘟病毒结构蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及评价

通过研究猪瘟(CSF)疫苗免疫猪抗结构蛋白E2、E0和C抗体的产生规律,为临床制定合理的CSF疫苗免疫程序提供参考。利用间接ELISA方法检测CSF疫苗免疫猪过程中,抗E2抗原血清抗体的产生特征;分别以重组猪瘟病毒(CSFV)结构蛋白E0和C为抗原,建立检测血清抗体的间接ELISA方法,评价其敏感性和特异性,并检测疫苗免疫过程中抗E0和C蛋白抗体的消长规律。结果显示:CSFV-E0和CSFV-C间接ELISA抗体检测方法的抗原最佳包被质量浓度分别为2.09和1.59μg/mL,待检血清样本最适稀释度分别为1∶60和1∶80,酶标二抗稀释度分别为1∶100和1∶350,2种ELISA方法与常见猪病原的阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性。CSF疫苗免疫后第7天即可检测到抗E2、E0和C蛋白的抗体,其中抗E2和E0的抗体在免疫后第21天达到最高水平,E2抗体滴度先上升后下降,E0抗体在免疫后第21天开始下降并最终趋于稳定;C蛋白抗体在免疫后第7天出现,随后开始下降,在第28天转为阴性。结果表明,利用重组抗原建立的CSFV血清抗体ELISA检测方法,可以用于评价CSF疫苗免疫后血清中针对3种结构蛋白的抗体消长特点,从而为临床猪瘟疫苗免疫程序的制定提供参考。     

PCV2衣壳蛋白肽段的表达及其血清抗体间接ELISA检测方法

利用可溶性重组PCV2-Cap蛋白肽段为抗原,建立PCV2血清抗体间接ELISA诊断方法(rhcap-ELISA)。将PCV2cap基因中含主要表位的片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至18℃诱导,获得大小为34 ku的可溶性融合蛋白。Western blotting试验证实该融合蛋白具有很强的免疫学活性,通过亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化。用融合表达的可溶性蛋白肽段作为抗原,建立猪圆环病毒(PCV2)血清抗体间接ELISA诊断方法。该方法的交叉反应结果表明,重组抗原与PRRSV、CSF、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rhcap-ELISA和商品化的同类试剂盒(PCV2-Ab-Kit)检测137送检血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为79.56%和83.21%。因此,rhcap-ELISA猪圆环病毒抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合于在大规模的PCV2血清抗体的检测工作中使用。     

黑山羊传染性胸膜肺炎和羊口疮混合感染的诊断报告

1 发病情况 2009年5月到6月湖北省某羊场从四川省某公司(每家每户散养后集中),分3批购得黑山羊847只.第1批羊购进后第3天出现咳嗽并死亡1只,第15天有30%羊群表现出咳嗽症状,第20天约有80%的羊表现为精神沉郁,食欲减退,咳嗽,消瘦同时,口、唇部结痂并出现大批死亡,第2批羊购进后和第1批羊混合饲养,其中第3批的192只羊买回后即转手卖给当地农户.发病后该羊场在没有确诊的情况下凭技术人员养殖经验先后使用了13种药物进行治疗,但疗效不明显.截止2009年8月1日死亡率为24.7%(162/655).2009年8月1日笔者赶到发病羊场,经现场调查、剖检和实验室诊断确诊为羊传染性胸膜肺炎和羊口疮混合感染.     

高致病性猪蓝耳病病毒GS/LZh/07株的分离、鉴定及其非结构蛋白Nsp2基因特性分析

将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,发现所扩增到的Nsp2基因有90个核苷酸的缺失。序列比对结果表明：该分离病毒Nsp2基因与经典毒株PRRSV-ch-1a核苷酸同源性为83.0%,氨基酸同源性为72.7%;与高致病性变异毒株NX和SD核苷酸同源性为95.5%,氨基酸同源性为90.9%,可见该毒来源于2006-2007年流行毒株,说明高致病性猪蓝耳病变异病毒已经在甘肃省存在。该毒株的成功分离为高致病性猪蓝耳病流行病学调查分析提供数据,也为预防控制该病积累了资料。Nsp2的特性分析为揭示高致病性猪蓝耳病PRRSV在甘肃省的流行特点提供参考。     

逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳前体基因（P1）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞（BHK-21）。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

羊口疮病毒疫苗株与野毒株VIL-10基因的比较分析

试验旨在比较分析羊口疮病毒（orf virus,ORFV）VIL-10基因在疫苗株和野毒株之间的差异特征。参照GenBank中公布的ORFV NZ2株的VIL-10基因序列设计并合成1对特异性引物,分别以疫苗株和野毒株提取的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ORFV的VIL-10基因全序列并进行测序,应用生物信息学相关软件分析基因的核苷酸、氨基酸变异情况及蛋白结构。结果显示,本试验测定的疫苗株和野毒株VIL-10基因核苷酸序列同源性为94.4%,差异主要是单个碱基的突变,其中疫苗株在132~134 bp核苷酸序列出现缺失;氨基酸序列同源性为92.5%,出现了15个氨基酸位点的突变,其中疫苗株第42位氨基酸天冬酰胺出现缺失;蛋白质在一级结构及理化性质、二级结构、三级结构、抗原表位参数及有无信号肽之间均存在一定程度的差异,而疫苗株和野毒株编码的蛋白质均无跨膜结构域。系统进化树分析结果表明,本试验测定的野毒株与疫苗株属于不同分支,遗传关系较远。研究结果提示,野毒株与疫苗株的VIL-10基因发生较明显的变异,这些变异可能与ORFV疫苗株的毒力致弱有关。     

羊重要传染性疾病的流行与防制

正目前,我国羊传染病主要有35种,其中病毒性11种,细菌性18种,其他微生物致病的6种,病毒性的包括:口蹄疫、羊传染性脓疱、羊痘、小反刍兽疫、蓝舌病等,细菌性的包括:炭疽、破伤风、布氏杆菌病、副结核病、羊快疫等,其他病原体导致的:羊衣原体病、羊支原体肺炎、羊钩端螺旋体病、附红体病等。     

乳牛乳腺炎多联苗免疫母乳的乳腺抗感染试验研究

用泌乳母鼠乳腺作疾病模型，研究了乳牛乳腺炎多联苗对乳腺组织抗金黄色葡萄球菌感染的免疫保护作用。试验发现，将金黄色葡萄球菌（84184）接种子母鼠乳腺内，可使乳腺出现较为明显的急性炎症，在攻菌后24、36h免疫组的乳腺发病率均明显低于对照组；取乳腺组织匀浆后进行细菌计数，免疫组攻菌后24h的细菌数与攻菌细菌数接近，而对照组则比攻菌细菌数明显增多（P＜0．01）。攻菌后36h两个组的细菌数均比攻菌数增加，对照组增加更为明显（P＜0．05）；组织学检查可见，免疫组乳腺的上皮细胞病变程度比对照组明显轻微，而其乳淋巴组织则比对照组表现出更为强烈的免疫反应。结果表明，多联苗全身免疫泌乳母鼠后可显著增强乳腺局部的抗感染能力，延缓乳腺组织的病变进程。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

以细胞总基因组提取试剂盒抽提PCV2细胞毒株总DNA为模板,用特异性引物扩增PCV2 ORF3基因。将ORF3和表达载体pGEX-6p-1用BamH I和Sal I双酶切回收后连接,将测序验证为阳性的重组质粒命名为pGEX-6p-1-ORF3。重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达并纯化,对获得的表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测。结果表明:PCV2 ORF3在pGEX-6p-1中获得了高效表达,其表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约为37 kD,且能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用,具有免疫学活性。     

口蹄疫病毒牛源整联蛋白受体β3、β8亚基基因的克隆及分子特征分析

本研究旨在从分子角度阐明口蹄疫病毒(FMDV)牛源整联蛋白受体β3和β8基因的结构特征,并为研究病毒遗传变异与宿主范围改变奠定基础。采用RT-PCR技术在国内首次从牛肾组织获得β3和β8基因,并用生物软件对它们的分子特征进行了分析。结果显示:β3亚基基因全长2 355bp,编码784个氨基酸,其中信号肽由22个氨基酸组成,胞外区由692个氨基酸组成,跨膜区由29个氨基酸组成,胞质区由41个氨基酸组成,氨基酸同源性与羊最高,与易感FMDV的牛、骆驼、猪和羊的β3亚基位于同一进化分支,各功能区的保守性为胞质区>跨膜区>配体结合区>胞外区>信号肽,但半胱氨酸富集区的突变率仅次于信号肽。牛源β8亚基基因全长2 304bp,编码767个氨基酸,包括42个氨基酸的信号肽,637个氨基酸的胞外区,29个氨基酸的跨膜区及59个氨基酸的胞质区,氨基酸同源性与马最高,进化分析发现与猪的β8亚基不在同一分支,各功能区的保守性排序为跨膜区>配体结合区>胞质区>胞外区>信号肽。将β3亚基与β8亚基比较发现,β8亚基的配体结合区比β3亚基更为保守,β3亚基的胞质区存在NPLY基序,而β8亚基无此基序,且β8亚基胞质区可变性更高。本研究提示FMDV对ανβ8的利用率高于ανβ3可能与β8亚基配体结合区更为保守有关。